Javascript je aktuálně ve vašem prohlížeči zakázán.Když je javascript zakázán, některé funkce tohoto webu nebudou fungovat.
Zaregistrujte své konkrétní údaje a konkrétní léky, které vás zajímají, a my vám poskytnuté informace spojíme s články v naší rozsáhlé databázi a včas vám zašleme kopii PDF e-mailem.
Jsou menší nanočástice vždy lepší?Pochopit biologické účinky agregace nanočástic stříbra v závislosti na velikosti za biologicky relevantních podmínek
Autoři: Bélteky P, Rónavári A, Zakupszky D, Boka E, Igaz N, Szerencsés B, Pfeiffer I, Vágvölgyi C, Kiricsi M, Kónya Z
Péter Bélteky,1,* Andrea Rónavári,1,* Dalma Zakupszky,1 Eszter Boka,1 Nóra Igaz,2 Bettina Szerencsés,3 Ilona Pfeiffer,3 Csaba Vágvölgyi,3 Mónika Kiricsi z chemie životního prostředí, Maďarsko, Maďarsko Fakulta vědy a informatiky , Univerzita v Szegedu;2 Ústav biochemie a molekulární biologie, Přírodovědecká a informační fakulta, Univerzita v Szegedu, Maďarsko;3 Katedra mikrobiologie, Přírodovědecká a informační fakulta, Univerzita v Szegedu, Maďarsko;4MTA-SZTE Reaction Kinetics and Surface Chemistry Research Group, Szeged, Maďarsko* Tito autoři se na této práci podíleli stejnou měrou.Komunikace: Zoltán Kónya Katedra aplikované chemie a chemie životního prostředí, Fakulta vědy a informatiky, Univerzita v Szegedu, Rerrich Square 1, Szeged, H-6720, Maďarsko Telefon +36 62 544620 E-mail [Ochrana e-mailu] Účel: Nanočástice stříbra (AgNP) jsou jeden z nejčastěji studovaných nanomateriálů, zejména díky jejich biomedicínským aplikacím.V důsledku agregace nanočástic je však jejich vynikající cytotoxicita a antibakteriální aktivita v biologických médiích často ohrožena.V této práci bylo studováno agregační chování a související biologické aktivity tří různých vzorků nanočástic stříbra zakončených citrátem o středním průměru 10, 20 a 50 nm.Metoda: Pomocí transmisního elektronového mikroskopu syntetizujte a charakterizujte nanočástice, vyhodnoťte jejich agregační chování při různých hodnotách pH, ​​koncentracích NaCl, glukózy a glutaminu pomocí dynamického rozptylu světla a ultrafialové spektroskopie.Kromě toho složky buněčného kultivačního média, jako je Dulbecco, zlepšují agregační chování v médiu Eagle a fetálním telecím séru.Výsledky: Výsledky ukazují, že kyselé pH a fyziologický obsah elektrolytů obecně indukují agregaci v mikronovém měřítku, která může být zprostředkována tvorbou biomolekulární koróny.Stojí za zmínku, že větší částice vykazují vyšší odolnost vůči vnějším vlivům než jejich menší protějšky.In vitro testy cytotoxicity a antibakteriální testy byly provedeny ošetřením buněk agregáty nanočástic v různých fázích agregace.Závěr: Naše výsledky odhalují hlubokou korelaci mezi koloidní stabilitou a toxicitou AgNP, protože extrémní agregace vede k úplné ztrátě biologické aktivity.Vyšší stupeň antiagregace pozorovaný u větších částic má významný dopad na toxicitu in vitro, protože takové vzorky si zachovávají více antimikrobiální a savčí buněčné aktivity.Tato zjištění vedou k závěru, že navzdory obecnému názoru v příslušné literatuře nemusí být zacílení na nejmenší možné nanočástice tím nejlepším postupem.Klíčová slova: růst zprostředkovaný semeny, koloidní stabilita, agregační chování závislé na velikosti, toxicita poškození agregací
Vzhledem k tomu, že poptávka a produkce nanomateriálů stále roste, je stále více pozornosti věnováno jejich biologické bezpečnosti nebo biologické aktivitě.Nanočástice stříbra (AgNP) jsou jedním z nejčastěji syntetizovaných, zkoumaných a využívaných zástupců této třídy materiálů pro jejich vynikající katalytické, optické a biologické vlastnosti.1 Obecně se má za to, že jedinečné vlastnosti nanomateriálů (včetně AgNP) jsou připisovány především jejich velkému specifickému povrchu.Nevyhnutelným problémem je proto jakýkoli proces, který ovlivňuje tuto klíčovou vlastnost, jako je velikost částic, povrchový povlak nebo agregace, zda vážně poškodí vlastnosti nanočástic, které jsou kritické pro konkrétní aplikace.
Účinky velikosti částic a stabilizátorů jsou předměty, které byly poměrně dobře zdokumentovány v literatuře.Například obecně přijímaný názor je, že menší nanočástice jsou toxičtější než větší nanočástice.2 V souladu s obecnou literaturou naše předchozí studie prokázaly velikostně závislou aktivitu nanostříbra na savčí buňky a mikroorganismy.3– 5 Povrchová úprava je dalším atributem, který má široký vliv na vlastnosti nanomateriálů.Pouhým přidáním nebo úpravou stabilizátorů na jeho povrchu může mít stejný nanomateriál zcela odlišné fyzikální, chemické a biologické vlastnosti.Aplikace capping agentů se nejčastěji provádí v rámci syntézy nanočástic.Například nanočástice stříbra zakončené citrátem jsou jedním z nejdůležitějších AgNP ve výzkumu, které jsou syntetizovány redukcí solí stříbra ve vybraném roztoku stabilizátoru jako reakčního média.6 Citrát může snadno využít své nízké ceny, dostupnosti, biokompatibility a silné afinity ke stříbru, což se může odrazit v různých navrhovaných interakcích, od reverzibilní povrchové adsorpce po iontové interakce.Malé molekuly a polyatomické ionty blízké 7,8, jako jsou citráty, polymery, polyelektrolyty a biologická činidla, se také běžně používají ke stabilizaci nano-stříbra a provádění jedinečných funkcionalizací na něm.9-12
I když je možnost změny aktivity nanočástic záměrným povrchovým zakrýváním velmi zajímavou oblastí, hlavní role tohoto povrchového povlaku je zanedbatelná a zajišťuje koloidní stabilitu systému nanočástic.Velký specifický povrch nanomateriálů bude produkovat velkou povrchovou energii, která brání termodynamické schopnosti systému dosáhnout minimální energie.13 Bez řádné stabilizace to může vést k aglomeraci nanomateriálů.Agregace je vytváření agregátů částic různých tvarů a velikostí, ke kterému dochází, když se dispergované částice setkají a současné termodynamické interakce umožňují částicím přilnout k sobě navzájem.Stabilizátory se proto používají k zabránění agregace zavedením dostatečně velké odpudivé síly mezi částice, která působí proti jejich termodynamické přitažlivosti.14
Přestože téma velikosti částic a pokrytí povrchu bylo důkladně prozkoumáno v kontextu jeho regulace biologických aktivit spouštěných nanočásticemi, je agregace částic do značné míry opomíjenou oblastí.Neexistuje téměř žádná důkladná studie, která by řešila koloidní stabilitu nanočástic za biologicky relevantních podmínek.10,15-17 Kromě toho je tento příspěvek zvláště vzácný tam, kde byla také studována toxicita spojená s agregací, i když může způsobit nežádoucí reakce, jako je vaskulární trombóza, nebo ztráta požadovaných vlastností, jako je její toxicita, např. znázorněno na obrázku 1.18, 19 zobrazeno.Ve skutečnosti jeden z mála známých mechanismů rezistence nanočástic stříbra souvisí s agregací, protože se uvádí, že určité kmeny E. coli a Pseudomonas aeruginosa snižují svou citlivost na nanostříbro tím, že exprimují protein flagelin, flagellin.Má vysokou afinitu ke stříbru, čímž vyvolává agregaci.20
Existuje několik různých mechanismů souvisejících s toxicitou nanočástic stříbra a agregace ovlivňuje všechny tyto mechanismy.Nejdiskutovanější metoda biologické aktivity AgNP, někdy označovaná jako mechanismus „trojského koně“, považuje AgNP za přenašeče Ag+.1,21 Mechanismus trojského koně může zajistit velký nárůst lokální koncentrace Ag+, což vede ke vzniku ROS a depolarizaci membrány.22-24 Agregace může ovlivnit uvolňování Ag+, a tím ovlivnit toxicitu, protože snižuje účinný aktivní povrch, kde mohou být ionty stříbra oxidovány a rozpouštěny.AgNP však nebudou vykazovat toxicitu pouze uvolňováním iontů.Je třeba vzít v úvahu mnoho interakcí souvisejících s velikostí a morfologií.Mezi nimi jsou určujícími vlastnostmi velikost a tvar povrchu nanočástic.4,25 Soubor těchto mechanismů lze kategorizovat jako „mechanismy indukované toxicity“.Existuje potenciálně mnoho mitochondriálních a povrchových membránových reakcí, které mohou poškodit organely a způsobit buněčnou smrt.25-27 Protože tvorba agregátů přirozeně ovlivňuje velikost a tvar předmětů obsahujících stříbro rozpoznávaných živými systémy, mohou být ovlivněny i tyto interakce.
V našem předchozím článku o agregaci nanočástic stříbra jsme demonstrovali efektivní screeningový postup sestávající z chemických a in vitro biologických experimentů ke studiu tohoto problému.19 Dynamický rozptyl světla (DLS) je preferovanou technikou pro tyto typy kontrol, protože materiál může rozptylovat fotony na vlnové délce srovnatelné s velikostí jeho částic.Protože Brownova rychlost pohybu částic v kapalném prostředí souvisí s velikostí, lze změnu intenzity rozptýleného světla použít ke stanovení průměrného hydrodynamického průměru (Z-střední hodnota) kapalného vzorku.28 Navíc přivedením napětí na vzorek lze měřit zeta potenciál (ζ potenciál) nanočástice podobně jako Z průměrnou hodnotu.13,28 Pokud je absolutní hodnota zeta potenciálu dostatečně vysoká (podle obecných směrnic > ±30 mV), bude mezi částicemi generovat silné elektrostatické odpuzování, které působí proti agregaci.Charakteristická povrchová plazmonová rezonance (SPR) je unikátní optický jev, připisovaný především nanočásticím drahých kovů (hlavně Au a Ag).29​​ Na základě elektronických oscilací (povrchových plazmonů) těchto materiálů v nanoměřítku je známo, že sférické AgNP mají charakteristický UV-Vis absorpční vrchol blízko 400 nm.30 K doplnění výsledků DLS se používá intenzita a posun vlnových délek částic, protože tuto metodu lze použít k detekci agregace nanočástic a povrchové adsorpce biomolekul.
Na základě získaných informací se provádějí testy buněčné viability (MTT) a antibakteriální testy způsobem, ve kterém je toxicita AgNP popsána jako funkce úrovně agregace, spíše než (nejběžněji používaný faktor) koncentrace nanočástic.Tato unikátní metoda nám umožňuje demonstrovat hluboký význam úrovně agregace v biologické aktivitě, protože například citrátem zakončené AgNP zcela ztrácejí svou biologickou aktivitu během několika hodin v důsledku agregace.19
V současné práci se snažíme výrazně rozšířit naše předchozí příspěvky ve stabilitě bio-příbuzných koloidů a jejich vlivu na biologickou aktivitu studiem vlivu velikosti nanočástic na agregaci nanočástic.Jedná se nepochybně o jednu ze studií nanočástic.Pohled z vyššího profilu a 31 Ke zkoumání tohoto problému byla použita metoda růstu zprostředkovaného semeny k produkci citrátem zakončených AgNP ve třech různých velikostních rozmezích (10, 20 a 50 nm).6,32 jako jedna z nejběžnějších metod.Pro nanomateriály, které jsou široce a rutinně používány v lékařských aplikacích, jsou vybírány citrátem zakončené AgNP různých velikostí pro studium možné závislosti na velikosti biologických vlastností nanostříbra souvisejících s agregací.Po syntéze AgNP různých velikostí jsme vyrobené vzorky charakterizovali transmisní elektronovou mikroskopií (TEM) a poté zkoumali částice pomocí výše uvedeného screeningového postupu.Navíc v přítomnosti in vitro buněčných kultur Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) a Fetal Bovine Serum (FBS) bylo hodnoceno agregační chování závislé na velikosti a jeho chování při různých hodnotách pH, ​​koncentracích NaCl, glukózy a glutaminu.Charakteristiky cytotoxicity jsou stanoveny za komplexních podmínek.Vědecký konsenzus naznačuje, že obecně jsou vhodnější menší částice;naše vyšetřování poskytuje chemickou a biologickou platformu k určení, zda tomu tak je.
Tři nanočástice stříbra s různými rozsahy velikostí byly připraveny metodou růstu zprostředkovaného semeny, kterou navrhli Wan et al., s mírnými úpravami.6 Tato metoda je založena na chemické redukci s použitím dusičnanu stříbrného (AgNO3) jako zdroje stříbra, borohydridu sodného (NaBH4) jako redukčního činidla a citrátu sodného jako stabilizátoru.Nejprve připravte 75 ml 9 mM vodného roztoku citrátu z dihydrátu citrátu sodného (Na3C6H5O7 x 2H2O) a zahřejte na 70 °C.Poté byly k reakčnímu médiu přidány 2 ml 1% hmotn./obj. roztoku AgN03 a poté byl do směsi po kapkách nalit čerstvě připravený roztok borohydridu sodného (2 ml 0,1% hmotn./obj.).Výsledná žlutohnědá suspenze se 1 hodinu udržuje při 70 °C za intenzivního míchání a poté se ochladí na teplotu místnosti.Výsledný vzorek (od nynějška označovaný jako AgNP-I) se použije jako základ pro růst zprostředkovaný semeny v dalším kroku syntézy.
Pro syntézu středně velké suspenze částic (označené jako AgNP-II) zahřejte 90 ml 7,6 mM roztoku citrátu na 80 °C, smíchejte jej s 10 ml AgNP-I a poté přimíchejte 2 ml 1% w/v roztoku AgNO3 se udržuje za intenzivního mechanického míchání po dobu 1 hodiny a poté se vzorek ochladí na teplotu místnosti.
Pro největší částici (AgNP-III) opakujte stejný růstový proces, ale v tomto případě použijte 10 ml AgNP-II jako suspenzi semen.Poté, co vzorky dosáhnou pokojové teploty, nastaví svou nominální koncentraci Ag na základě celkového obsahu AgNO3 na 150 ppm přidáním nebo odpařením dalšího rozpouštědla při 40 °C a nakonec je skladují při 4 °C do dalšího použití.
Použijte FEI Tecnai G2 20 X-Twin transmisní elektronový mikroskop (TEM) (FEI Corporate Headquarters, Hillsboro, Oregon, USA) s urychlovacím napětím 200 kV pro zkoumání morfologických charakteristik nanočástic a zachycení jejich elektronového difrakčního (ED) obrazce.Nejméně 15 reprezentativních snímků (~750 částic) bylo vyhodnoceno pomocí softwarového balíku ImageJ a výsledné histogramy (a všechny grafy v celé studii) byly vytvořeny v OriginPro 2018 (OriginLab, Northampton, MA, USA) 33, 34.
Průměrný hydrodynamický průměr (Z-průměr), zeta potenciál (ζ-potenciál) a charakteristická povrchová plazmonová rezonance (SPR) vzorků byly měřeny pro ilustraci jejich počátečních koloidních vlastností.Průměrný hydrodynamický průměr a zeta potenciál vzorku byly měřeny přístrojem Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK) s použitím jednorázových skládaných kapilárních buněk při 37±0,1 °C.K získání charakteristických SPR charakteristik z UV-Vis absorpčních spekter vzorků v rozsahu 250-800 nm byl použit spektrofotometr Ocean Optics 355 DH-2000-BAL UV-Vis (Halma PLC, Largo, FL, USA).
V průběhu celého experimentu byly současně prováděny tři různé typy měření týkající se koloidní stability.Použijte DLS k měření průměrného hydrodynamického průměru (Z průměr) a zeta potenciálu (ζ potenciál) částic, protože Z průměr souvisí s průměrnou velikostí agregátů nanočástic a zeta potenciál ukazuje, zda elektrostatické odpuzování v systému je dostatečně silný, aby vyrovnal Van der Waalsovu přitažlivost mezi nanočásticemi.Měření se provádějí trojmo a standardní odchylka střední hodnoty Z a potenciálu zeta se vypočítá pomocí softwaru Zetasizer.Charakteristická SPR spektra částic jsou hodnocena UV-Vis spektroskopií, protože změny v intenzitě píku a vlnové délce mohou indikovat agregaci a povrchové interakce.29,35 Povrchová plazmonová rezonance v drahých kovech je ve skutečnosti tak vlivná, že vedla k novým metodám analýzy biomolekul.29,36,37 Koncentrace AgNP v experimentální směsi je asi 10 ppm a účelem je nastavit intenzitu maximální počáteční absorpce SPR na 1. Experiment byl proveden časově závislým způsobem při 0;1,5;3;6;12 a 24 hodin za různých biologicky relevantních podmínek.Další podrobnosti popisující experiment lze vidět v naší předchozí práci.19 Stručně řečeno, různé hodnoty pH (3; 5; 7,2 a 9), různé koncentrace chloridu sodného (10 mM; 50 mM; 150 mM), glukózy (3,9 mM; 6,7 mM) a glutaminu (4 mM) a také připravil Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) a Fetal Bovine Serum (FBS) (ve vodě a DMEM) jako modelové systémy a studoval jejich účinky na agregační chování syntetizovaných nanočástic stříbra.pH Hodnoty NaCl, glukózy a glutaminu jsou hodnoceny na základě fyziologických koncentrací, zatímco množství DMEM a FBS jsou stejná jako hladiny použité v celém in vitro experimentu.38-42 Všechna měření byla provedena při pH 7,2 a 37 °C s konstantní koncentrací soli na pozadí 10 mM NaCl, aby se eliminovaly jakékoli interakce částic na velkou vzdálenost (kromě určitých experimentů s pH a NaCl, kde jsou tyto atributy proměnnými pod studie).28 Seznam různých podmínek je shrnut v tabulce 1. Experiment označený † se používá jako referenční a odpovídá vzorku obsahujícímu 10 mM NaCl a pH 7,2.
Lidská buněčná linie rakoviny prostaty (DU145) a imortalizované lidské keratinocyty (HaCaT) byly získány od ATCC (Manassas, VA, USA).Buňky se rutinně kultivují v Dulbeccově minimálním základním médiu Eagle (DMEM) obsahujícím 4,5 g/l glukózy (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), doplněném 10 % FBS, 2 mM L-glutaminem, 0,01 % streptomycinem a 0,005 % Penicilin (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA).Buňky se kultivují v inkubátoru při 37 °C pod 5 % CO2 a 95 % vlhkosti.
Aby bylo možné prozkoumat změny v cytotoxicitě AgNP způsobené agregací částic časově závislým způsobem, byl proveden dvoukrokový test MTT.Nejprve byla měřena životaschopnost těchto dvou typů buněk po ošetření AgNP-I, AgNP-II a AgNP-III.Za tímto účelem byly dva typy buněk vysety do 96jamkových destiček v hustotě 10 000 buněk/jamku a druhý den byly ošetřeny třemi různými velikostmi nanočástic stříbra ve zvyšujících se koncentracích.Po 24 hodinách působení byly buňky promyty PBS a inkubovány s 0,5 mg/ml MTT činidlem (SERVA, Heidelberg, Německo) zředěným v kultivačním médiu po dobu 1 hodiny při 37 °C.Krystaly formazanu byly rozpuštěny v DMSO (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) a absorpce byla měřena při 570 nm pomocí čtečky destiček Synergy HTX (BioTek-Hungary, Budapešť, Maďarsko).Hodnota absorpce neošetřeného kontrolního vzorku se považuje za 100% míru přežití.Proveďte alespoň 3 experimenty za použití čtyř nezávislých biologických replikátů.IC50 se vypočítá z křivky odpovědi na dávku na základě výsledků vitality.
Poté, ve druhém kroku, inkubací částic se 150 mM NaCl po různá časová období (0, 1,5, 3, 6, 12 a 24 hodin) před ošetřením buněk, byly vytvořeny různé stavy agregace nanočástic stříbra.Následně byl proveden stejný test MTT, jak bylo popsáno dříve, aby se vyhodnotily změny v životaschopnosti buněk ovlivněné agregací částic.Pomocí GraphPad Prism 7 vyhodnoťte konečný výsledek, vypočítejte statistickou významnost experimentu nepárovým t-testem a označte jeho úroveň jako * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01), *** (p ≤ 0,001 ) A **** (p ≤ 0,0001).
Tři různé velikosti nanočástic stříbra (AgNP-I, AgNP-II a AgNP-III) byly použity pro antibakteriální citlivost na Cryptococcus neoformans IFM 5844 (IFM; Výzkumné centrum pro patogenní houby a mikrobiální toxikologii, Chiba University) a Bacillus Test megaterium SZMC 6031 (SZMC: Szeged Microbiology Collection) a E. coli SZMC 0582 v médiu RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Co.).Aby bylo možné vyhodnotit změny v antibakteriální aktivitě způsobené agregací částic, byla nejprve stanovena jejich minimální inhibiční koncentrace (MIC) mikroředěním v 96jamkové mikrotitrační destičce.K 50 μl standardizované buněčné suspenze (5 × 104 buněk/ml v médiu RPMI 1640) přidejte 50 μl suspenze nanočástic stříbra a sériově řeďte dvojnásobnou koncentraci (ve výše uvedeném médiu je rozsah 0 a 75 ppm, tzn. kontrolní vzorek obsahuje 50 μL buněčné suspenze a 50 μL média bez nanočástic).Poté byla destička inkubována při 30 °C po dobu 48 hodin a optická hustota kultury byla měřena při 620 nm pomocí SPECTROstar Nano plate reader (BMG LabTech, Offenburg, Německo).Experiment byl proveden třikrát v triplikátech.
Kromě toho, že v této době bylo použito 50 μl jednotlivých agregovaných vzorků nanočástic, byl ke zkoumání účinku agregace na antibakteriální aktivitu na výše uvedené kmeny použit stejný postup, jaký byl popsán dříve.Různé stavy agregace nanočástic stříbra jsou produkovány inkubací částic se 150 mM NaCl po různé časové úseky (0, 1,5, 3, 6, 12 a 24 hodin) před zpracováním buněk.Jako kontrola růstu byla použita suspenze doplněná 50 ul média RPMI 1640, zatímco pro kontrolu toxicity byla použita suspenze s neagregovanými nanočásticemi.Experiment byl proveden třikrát v triplikátech.Pomocí GraphPad Prism 7 znovu vyhodnoťte konečný výsledek za použití stejné statistické analýzy jako u analýzy MTT.
Úroveň agregace nejmenších částic (AgNP-I) byla charakterizována a výsledky byly částečně publikovány v naší předchozí práci, ale pro lepší srovnání byly všechny částice důkladně prozkoumány.Experimentální data jsou shromážděna a diskutována v následujících částech.Tři velikosti AgNP.19
Měření provedená pomocí TEM, UV-Vis a DLS ověřila úspěšnou syntézu všech vzorků AgNP (obrázek 2A-D).Podle prvního řádku na obrázku 2 vykazuje nejmenší částice (AgNP-I) jednotnou sférickou morfologii se středním průměrem asi 10 nm.Metoda růstu zprostředkovaného semeny také poskytuje AgNP-II a AgNP-III s různými rozsahy velikostí se středními průměry částic přibližně 20 nm a 50 nm, v daném pořadí.Podle směrodatné odchylky distribuce částic se velikosti tří vzorků nepřekrývají, což je důležité pro jejich srovnávací analýzu.Porovnáním průměrného poměru stran a poměru tenkosti částicových 2D projekcí na bázi TEM se předpokládá, že kulovitost částic je vyhodnocena zásuvným modulem tvarového filtru ImageJ (obrázek 2E).43 Podle analýzy tvaru částic není jejich poměr stran (velká strana/krátká strana nejmenšího ohraničujícího obdélníku) ovlivněn růstem částic a poměr jejich tenkosti (měřená plocha odpovídajícího dokonalého kruhu/teoretická plocha ) postupně klesá.To má za následek stále více polyedrických částic, které jsou teoreticky dokonale kulaté, což odpovídá poměru tenkosti 1.
Obrázek 2 Snímek (A) z transmisního elektronového mikroskopu (TEM), obraz elektronové difrakce (ED) (B), histogram distribuce velikosti (C), charakteristické spektrum absorpce ultrafialového (UV-Vis) světla (D) a průměrná kapalina citrát -ukončené stříbrné nanočástice s mechanickým průměrem (Z-průměr), zeta potenciálem, poměrem stran a poměrem tloušťky (E) mají tři různé rozsahy velikostí: AgNP-I je 10 nm (horní řada), AgNP -II je 20 nm (střední řada AgNP-III (spodní řada) je 50 nm.
Přestože cyklická povaha metody růstu do určité míry ovlivnila tvar částic, což mělo za následek menší kulovitost větších AgNP, všechny tři vzorky zůstaly kvazisférické.Navíc, jak ukazuje elektronový difrakční obrazec na obrázku 2B, nano Krystalinita částic není ovlivněna.Výrazný difrakční prstenec – který lze korelovat s (111), (220), (200) a (311) Millerovými indexy stříbra – je velmi konzistentní s vědeckou literaturou a našimi předchozími příspěvky.9, 19,44 Fragmentace Debye-Scherrerova prstence AgNP-II a AgNP-III je způsobena skutečností, že obraz ED je zachycen při stejném zvětšení, takže s rostoucí velikostí částic se počet difraktovaných částic na jednotková plocha se zvětšuje a zmenšuje.
Je známo, že velikost a tvar nanočástic ovlivňuje biologickou aktivitu.3,45 Tvarově závislá katalytická a biologická aktivita může být vysvětlena skutečností, že různé tvary mají tendenci proliferovat určité plochy krystalů (s různými Millerovými indexy) a tyto plochy krystalů mají různé aktivity.45,46 Protože připravené částice poskytují podobné výsledky ED odpovídající velmi podobným krystalovým charakteristikám, lze předpokládat, že v našich následných experimentech s koloidní stabilitou a biologickou aktivitou by jakékoli pozorované rozdíly měly být připsány velikosti nanočástic, nikoli vlastnostem souvisejícím s tvarem.
Výsledky UV-Vis shrnuté na obrázku 2D dále zdůrazňují ohromující sférickou povahu syntetizovaného AgNP, protože SPR píky všech tří vzorků jsou kolem 400 nm, což je charakteristická hodnota pro sférické nanočástice stříbra.29,30 Zachycená spektra také potvrdila úspěšný růst nanostříbra zprostředkovaný semeny.Jak se zvětšuje velikost částic, vlnová délka odpovídající maximální absorpci světla AgNP-II-výrazněji-Podle literatury zaznamenal AgNP-III rudý posun.6,29
Pokud jde o počáteční koloidní stabilitu systému AgNP, DLS byla použita k měření průměrného hydrodynamického průměru a zeta potenciálu částic při pH 7,2.Výsledky znázorněné na obrázku 2E ukazují, že AgNP-III má vyšší koloidní stabilitu než AgNP-I nebo AgNP-II, protože společná doporučení naznačují, že pro dlouhodobou koloidní stabilitu je nezbytný zeta potenciál 30 mV absolutní. Toto zjištění je dále podpořeno, když průměrná hodnota Z (získaná jako průměrný hydrodynamický průměr volných a agregovaných částic) se porovnává s primární velikostí částic získanou metodou TEM, protože čím blíže jsou tyto dvě hodnoty, tím mírnější je stupeň Gather ve vzorku.Ve skutečnosti je Z průměr AgNP-I a AgNP-II přiměřeně vyšší než jejich hlavní velikost částic vyhodnocená TEM, takže ve srovnání s AgNP-III se u těchto vzorků předpokládá větší pravděpodobnost agregace, kde je vysoce negativní zeta potenciál je doprovázena blízkou velikostí Průměrná hodnota Z.
Vysvětlení tohoto jevu může být dvojí.Na jedné straně je koncentrace citrátu udržována na podobné úrovni ve všech krocích syntézy, což poskytuje relativně vysoké množství nabitých povrchových skupin, aby se zabránilo snížení specifického povrchu rostoucích částic.Podle Levaka a kol. však mohou být malé molekuly, jako je citrát, snadno vyměněny za biomolekuly na povrchu nanočástic.V tomto případě bude koloidní stabilita určena korónou produkovaných biomolekul.31 Protože toto chování bylo pozorováno i při našich agregačních měřeních (podrobněji pojednáno později), samotný citrátový uzávěr nemůže tento jev vysvětlit.
Na druhé straně je velikost částic nepřímo úměrná tendenci k agregaci na úrovni nanometrů.To podporuje především tradiční metoda Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO), kde je přitahování částic popisováno jako součet přitažlivých a odpudivých sil mezi částicemi.Podle He et al. maximální hodnota energetické křivky DLVO klesá s velikostí nanočástic v nanočásticích hematitu, což usnadňuje dosažení minimální primární energie, a tím podporuje nevratnou agregaci (kondenzaci).47 Spekuluje se však o tom, že existují další aspekty za hranicemi teorie DLVO.Ačkoli van der Waalsova gravitace a elektrostatické odpuzování dvou vrstev jsou s rostoucí velikostí částic podobné, přehled Hotze et al.navrhuje, že má silnější účinek na agregaci, než umožňuje DLVO.14 Domnívají se, že povrchové zakřivení nanočástic již nelze odhadnout jako plochý povrch, takže matematický odhad není použitelný.Navíc, jak se velikost částic snižuje, procento atomů přítomných na povrchu se zvyšuje, což vede k elektronové struktuře a chování povrchového náboje.A mění se povrchová reaktivita, což může vést ke snížení náboje v elektrické dvojvrstvě a podporovat agregaci.
Při porovnávání výsledků DLS AgNP-I, AgNP-II a AgNP-III na obrázku 3 jsme pozorovali, že všechny tři vzorky vykazovaly podobnou agregaci vyvolávající pH.Silně kyselé prostředí (pH 3) posouvá zeta potenciál vzorku na 0 mV, což způsobuje, že částice vytvářejí agregáty o velikosti mikronů, zatímco alkalické pH posouvá jeho zeta potenciál na větší zápornou hodnotu, kdy částice tvoří menší agregáty (pH 5 ).A 7,2) ), nebo zůstanou zcela neagregované (pH 9).Byly také pozorovány některé důležité rozdíly mezi různými vzorky.V průběhu experimentu se ukázalo, že AgNP-I je nejcitlivější na změny zeta potenciálu vyvolané pH, protože zeta potenciál těchto částic byl snížen při pH 7,2 ve srovnání s pH 9, zatímco AgNP-II a AgNP-III vykazovaly pouze A značná změna v ζ je kolem pH 3. Kromě toho AgNP-II vykazoval pomalejší změny a mírný zeta potenciál, zatímco AgNP-III vykazoval nejmírnější chování ze všech tří, protože systém vykazoval nejvyšší absolutní hodnotu zeta a pomalý pohyb trendu, což naznačuje AgNP-III Nejodolnější vůči agregaci vyvolané pH.Tyto výsledky jsou v souladu s výsledky měření průměrného hydrodynamického průměru.Vezmeme-li v úvahu velikost částic jejich primerů, AgNP-I vykazoval konstantní postupnou agregaci při všech hodnotách pH, ​​nejpravděpodobněji kvůli 10 mM NaCl pozadí, zatímco AgNP-II a AgNP-III vykazovaly významnou pouze při pH 3 shromažďování.Nejzajímavější rozdíl je v tom, že navzdory své velké velikosti nanočástic tvoří AgNP-III nejmenší agregáty při pH 3 za 24 hodin, což zvýrazňuje jeho antiagregační vlastnosti.Vydělením průměrného Z AgNP při pH 3 po 24 hodinách hodnotou připraveného vzorku lze pozorovat, že relativní velikosti agregátů AgNP-I a AgNP-II se zvýšily 50krát, 42krát a 22krát. , resp.III.
Obrázek 3 Výsledky dynamického rozptylu světla vzorku nanočástic stříbra zakončených citrátem s rostoucí velikostí (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II a 50 nm: AgNP-III) jsou vyjádřeny jako průměrný hydrodynamický průměr (Z průměr ) (vpravo) Za různých podmínek pH se zeta potenciál (vlevo) změní během 24 hodin.
Pozorovaná agregace závislá na pH také ovlivnila charakteristickou rezonanci povrchového plasmonu (SPR) vzorků AgNP, jak dokazují jejich UV-Vis spektra.Podle doplňkového obrázku S1 je agregace všech tří suspenzí nanočástic stříbra následována snížením intenzity jejich SPR vrcholů a mírným červeným posunem.Rozsah těchto změn jako funkce pH je v souladu se stupněm agregace předpokládaným výsledky DLS, nicméně byly pozorovány některé zajímavé trendy.Na rozdíl od intuice se ukazuje, že středně velký AgNP-II je na změny SPR nejcitlivější, zatímco ostatní dva vzorky jsou méně citlivé.Ve výzkumu SPR je 50 nm teoretickým limitem velikosti částic, který se používá k rozlišení částic na základě jejich dielektrických vlastností.Částice menší než 50 nm (AgNP-I a AgNP-II) lze označit jako jednoduché dielektrické dipóly, zatímco částice, které dosáhnou nebo překročí tuto mez (AgNP-III), mají složitější dielektrické vlastnosti a jejich rezonance Pás se štěpí na multimodální změny .V případě dvou menších vzorků částic lze AgNP považovat za jednoduché dipóly a plazma se může snadno překrývat.Jak se zvětšuje velikost částic, tato vazba v podstatě produkuje větší plazmu, což může vysvětlit vyšší pozorovanou citlivost.29 Pro největší částice však jednoduchý odhad dipólu neplatí, pokud se mohou vyskytnout i jiné vazebné stavy, což může vysvětlit sníženou tendenci AgNP-III indikovat spektrální změny.29
V našich experimentálních podmínkách bylo prokázáno, že hodnota pH má zásadní vliv na koloidní stabilitu nanočástic stříbra potažených citrátem různých velikostí.V těchto systémech je stabilita zajištěna záporně nabitými -COO- skupinami na povrchu AgNP.Karboxylátová funkční skupina citrátového iontu je protonována ve velkém množství H+ iontů, takže vytvořená karboxylová skupina již nemůže zajistit elektrostatické odpuzování mezi částicemi, jak je znázorněno v horní řadě na obrázku 4. Podle Le Chatelierova principu AgNP vzorky rychle agregují při pH 3, ale postupně se se zvyšujícím se pH stávají stále stabilnějšími.
Obrázek 4 Schématický mechanismus povrchové interakce definovaný agregací při různém pH (horní řada), koncentraci NaCl (střední řada) a biomolekulách (spodní řada).
Podle obrázku 5 byla také zkoumána koloidní stabilita v suspenzích AgNP různých velikostí při zvyšujících se koncentracích soli.Na základě zeta potenciálu zvýšená velikost nanočástic v těchto systémech AgNP zakončených citrátem opět poskytuje zvýšenou odolnost vůči vnějším vlivům NaCl.V AgNP-I stačí 10 mM NaCl k vyvolání mírné agregace a koncentrace soli 50 mM poskytuje velmi podobné výsledky.V AgNP-II a AgNP-III 10 mM NaCl významně neovlivňuje zeta potenciál, protože jejich hodnoty zůstávají na (AgNP-II) nebo pod (AgNP-III) -30 mV.Zvýšení koncentrace NaCl na 50 mM a nakonec na 150 mM NaCl stačí k výraznému snížení absolutní hodnoty zeta potenciálu ve všech vzorcích, i když větší částice si uchovávají více negativního náboje.Tyto výsledky jsou v souladu s očekávaným průměrným hydrodynamickým průměrem AgNP;Z průměrné trendové čáry měřené na 10, 50 a 150 mM NaCl vykazují různé, postupně se zvyšující hodnoty.Nakonec byly ve všech třech 150 mM experimentech detekovány agregáty o velikosti mikronů.
Obrázek 5 Výsledky dynamického rozptylu světla vzorku nanočástic stříbra zakončených citrátem s rostoucí velikostí (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II a 50 nm: AgNP-III) jsou vyjádřeny jako průměrný hydrodynamický průměr (Z průměr ) (vpravo) a zeta potenciál (vlevo) se mění během 24 hodin při různých koncentracích NaCl.
Výsledky UV-Vis na doplňkovém obrázku S2 ukazují, že SPR 50 a 150 mM NaCl ve všech třech vzorcích má okamžitý a významný pokles.To lze vysvětlit pomocí DLS, protože agregace na bázi NaCl probíhá rychleji než experimenty závislé na pH, což se vysvětluje velkým rozdílem mezi časnými (0, 1,5 a 3 hodinami) měřeními.Kromě toho zvýšení koncentrace soli také zvýší relativní permitivitu experimentálního média, což bude mít hluboký vliv na rezonanci povrchového plasmonu.29
Účinek NaCl je shrnut v prostřední řadě na obrázku 4. Obecně lze usoudit, že zvýšení koncentrace chloridu sodného má podobný účinek jako zvýšení kyselosti, protože ionty Na+ mají tendenci koordinovat se kolem karboxylátových skupin, ionty Na+ mají tendenci se koordinovat kolem karboxylátových skupin. potlačení negativního zeta potenciálu AgNP.Kromě toho 150 mM NaCl vytvořilo mikronové agregáty ve všech třech vzorcích, což ukazuje, že fyziologická koncentrace elektrolytu je škodlivá pro koloidní stabilitu citrátem zakončených AgNP.Zvážením kritické kondenzační koncentrace (CCC) NaCl na podobných systémech AgNP lze tyto výsledky chytře umístit do příslušné literatury.Huynh a kol.vypočítali, že CCC NaCl pro nanočástice stříbra zakončené citrátem s průměrným průměrem 71 nm byl 47,6 mM, zatímco El Badawy et al.pozorovali, že CCC 10 nm AgNP s citrátovým povlakem byl 70 mM.10,16 Kromě toho byl He et al. naměřen významně vysoký CCC kolem 300 mM, což způsobilo, že jejich způsob syntézy se liší od výše uvedené publikace.48 Přestože současný příspěvek není zaměřen na komplexní analýzu těchto hodnot, protože naše experimentální podmínky narůstají ve složitosti celé studie, biologicky relevantní koncentrace NaCl 50 mM, zejména 150 mM NaCl, se zdá být poměrně vysoká.Indukovaná koagulace, vysvětlující zjištěné silné změny.
Dalším krokem v polymerizačním experimentu je použití jednoduchých, ale biologicky relevantních molekul k simulaci interakcí nanočástic a biomolekul.Na základě výsledků DLS (obrázky 6 a 7) a UV-Vis (doplňkové obrázky S3 a S4) lze vyvodit některé obecné závěry.V našich experimentálních podmínkách nebudou studované molekuly glukózy a glutaminu indukovat agregaci v žádném systému AgNP, protože trend Z-střední hodnoty úzce souvisí s odpovídající referenční hodnotou měření.Přestože jejich přítomnost neovlivňuje agregaci, experimentální výsledky ukazují, že tyto molekuly jsou částečně adsorbovány na povrchu AgNP.Nejvýraznějším výsledkem podporujícím tento názor je pozorovaná změna absorpce světla.Ačkoli AgNP-I nevykazuje smysluplné změny vlnové délky nebo intenzity, lze jej pozorovat jasněji měřením větších částic, což je pravděpodobně způsobeno vyšší optickou citlivostí zmíněnou dříve.Bez ohledu na koncentraci může glukóza způsobit větší červený posun po 1,5 hodině ve srovnání s kontrolním měřením, což je asi 40 nm u AgNP-II a asi 10 nm u AgNP-III, což dokazuje výskyt povrchových interakcí.Glutamin vykazoval podobný trend, ale změna nebyla tak patrná.Kromě toho také stojí za zmínku, že glutamin může snížit absolutní zeta potenciál středních a velkých částic.Protože se však nezdá, že tyto změny zeta ovlivňují úroveň agregace, lze spekulovat, že i malé biomolekuly, jako je glutamin, mohou poskytnout určitý stupeň prostorového odpuzování mezi částicemi.
Obrázek 6 Výsledky dynamického rozptylu světla vzorků nanočástic stříbra zakončených citrátem s rostoucí velikostí (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II a 50 nm: AgNP-III) jsou vyjádřeny jako střední hydrodynamický průměr (Z průměr) (vpravo) Za vnějších podmínek různých koncentrací glukózy se zeta potenciál (vlevo) změní během 24 hodin.
Obrázek 7 Výsledky dynamického rozptylu světla vzorku nanočástic stříbra zakončených citrátem s rostoucí velikostí (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II a 50 nm: AgNP-III) jsou vyjádřeny jako průměrný hydrodynamický průměr (Z průměr ) (vpravo) V přítomnosti glutaminu se zeta potenciál (vlevo) změní do 24 hodin.
Stručně řečeno, malé biomolekuly jako glukóza a glutamin neovlivňují koloidní stabilitu při měřené koncentraci: ačkoli ovlivňují zeta potenciál a výsledky UV-Vis v různé míře, výsledky Z průměru nejsou konzistentní.To naznačuje, že povrchová adsorpce molekul inhibuje elektrostatické odpuzování, ale zároveň poskytuje rozměrovou stabilitu.
Abychom propojili předchozí výsledky s předchozími výsledky a lépe simulovali biologické podmínky, vybrali jsme některé z nejčastěji používaných složek buněčné kultury a použili je jako experimentální podmínky pro studium stability AgNP koloidů.V celém in vitro experimentu je jednou z nejdůležitějších funkcí DMEM jako média nastolení nezbytných osmotických podmínek, ale z chemického hlediska se jedná o komplexní solný roztok s celkovou iontovou silou podobnou 150 mM NaCl. .40 Pokud jde o FBS, jedná se o komplexní směs biomolekul – především proteinů – z hlediska povrchové adsorpce má určité podobnosti s experimentálními výsledky glukózy a glutaminu, i přes chemické složení a rozmanitost Pohlaví je mnohem složitější.19 DLS a UV-Viditelné výsledky zobrazené na obrázku 8 a doplňkovém obrázku S5 lze vysvětlit zkoumáním chemického složení těchto materiálů a jejich korelací s měřeními v předchozí části.
Obrázek 8 Výsledky dynamického rozptylu světla vzorku nanočástic stříbra zakončených citrátem s rostoucí velikostí (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II a 50 nm: AgNP-III) jsou vyjádřeny jako průměrný hydrodynamický průměr (Z průměr ) (vpravo) V přítomnosti složek buněčné kultury DMEM a FBS se zeta potenciál (vlevo) mění během 24 hodin.
Ředění AgNP různých velikostí v DMEM má podobný účinek na koloidní stabilitu, jaký je pozorován v přítomnosti vysokých koncentrací NaCl.Disperze AgNP v 50 v/v % DMEM ukázala, že byla detekována agregace ve velkém měřítku se zvýšením zeta potenciálu a Z-průměrné hodnoty a prudkým poklesem intenzity SPR.Stojí za zmínku, že maximální velikost agregátu indukovaná DMEM po 24 hodinách je nepřímo úměrná velikosti nanočástic primeru.
Interakce mezi FBS a AgNP je podobná interakci pozorované v přítomnosti menších molekul, jako je glukóza a glutamin, ale účinek je silnější.Z průměr částic zůstává nedotčen, zatímco je detekován nárůst zeta potenciálu.Vrchol SPR vykazoval mírný červený posun, ale možná zajímavější je, že intenzita SPR neklesla tak výrazně jako u kontrolního měření.Tyto výsledky lze vysvětlit vrozenou adsorpcí makromolekul na povrchu nanočástic (spodní řada na obrázku 4), která je dnes chápána jako tvorba biomolekulární koróny v těle.49