Javascript je trenutno onemogočen v vašem brskalniku.Ko je javascript onemogočen, nekatere funkcije tega spletnega mesta ne bodo delovale.
Registrirajte svoje posebne podatke in posebna zdravila, ki vas zanimajo, in podatke, ki jih posredujete, bomo povezali s članki v naši obsežni zbirki podatkov in vam pravočasno poslali kopijo PDF po e-pošti.
Ali so manjši nanodelci vedno boljši?Razumeti biološke učinke od velikosti odvisne agregacije srebrovih nanodelcev v biološko pomembnih pogojih
Avtorji: Bélteky P, Rónavári A, Zakupszky D, Boka E, Igaz N, Szerencsés B, Pfeiffer I, Vágvölgyi C, Kiricsi M, Kónya Z
Péter Bélteky,1,* Andrea Rónavári,1,* Dalma Zakupszky,1 Eszter Boka,1 Nóra Igaz,2 Bettina Szerencsés,3 Ilona Pfeiffer,3 Csaba Vágvölgyi,3 Mónika Kiricsi iz okoljske kemije, Madžarska, Madžarska Fakulteta za naravoslovje in informatiko , Univerza v Szegedu;2 Oddelek za biokemijo in molekularno biologijo, Fakulteta za naravoslovje in informacije, Univerza v Szegedu, Madžarska;3 Oddelek za mikrobiologijo, Fakulteta za naravoslovje in informacije, Univerza v Szegedu, Madžarska;4MTA-SZTE Reaction Kinetics and Surface Chemistry Research Group, Szeged, Madžarska* Ti avtorji so enako prispevali k temu delu.Sporočilo: Zoltán Kónya Oddelek za uporabno in okoljsko kemijo, Fakulteta za naravoslovje in informatiko, Univerza v Szegedu, Rerrich Square 1, Szeged, H-6720, Madžarska Telefon +36 62 544620 E-pošta [Zaščita e-pošte] Namen: Nanodelci srebra (AgNP) so eden najpogosteje preučevanih nanomaterialov, zlasti zaradi njihove uporabe v biomedicini.Vendar sta zaradi agregacije nanodelcev njihova odlična citotoksičnost in antibakterijsko delovanje v bioloških medijih pogosto ogroženi.V tem delu so preučevali agregacijsko obnašanje in s tem povezane biološke aktivnosti treh različnih vzorcev srebrovih nanodelcev s citratno koncem s povprečnim premerom 10, 20 in 50 nm.Metoda: S transmisijskim elektronskim mikroskopom sintetizirajte in karakterizirajte nanodelce, ocenite njihovo agregacijsko obnašanje pri različnih pH vrednostih, koncentracijah NaCl, glukoze in glutamina z dinamičnim sipanjem svetlobe in ultravijolično vidno spektroskopijo.Poleg tega komponente v mediju celične kulture, kot je Dulbecco, izboljšajo agregacijsko obnašanje v mediju Eagle in fetalnem telečjem serumu.Rezultati: Rezultati kažejo, da kisel pH in fiziološka vsebnost elektrolitov na splošno inducirata agregacijo na mikronskem merilu, ki jo lahko posreduje tvorba biomolekularne korone.Omeniti velja, da so večji delci bolj odporni na zunanje vplive kot njihovi manjši delci.In vitro citotoksičnost in antibakterijski testi so bili izvedeni z obdelavo celic z agregati nanodelcev na različnih stopnjah agregacije.Zaključek: Naši rezultati razkrivajo globoko korelacijo med koloidno stabilnostjo in toksičnostjo AgNP, saj ekstremna agregacija povzroči popolno izgubo biološke aktivnosti.Višja stopnja antiagregacije, opažena pri večjih delcih, pomembno vpliva na toksičnost in vitro, ker takšni vzorci ohranijo več protimikrobne aktivnosti in aktivnosti celic sesalcev.Te ugotovitve vodijo do zaključka, da kljub splošnemu mnenju v ustrezni literaturi ciljanje na najmanjše možne nanodelce morda ni najboljši način ukrepanja.Ključne besede: rast, posredovana s semeni, koloidna stabilnost, od velikosti odvisno agregacijsko vedenje, strupenost zaradi poškodb agregacije
Ker povpraševanje in proizvodnja nanomaterialov še naprej naraščata, se vse več pozornosti namenja njihovi biološki varnosti ali biološki aktivnosti.Nanodelci srebra (AgNP) so zaradi svojih odličnih katalitičnih, optičnih in bioloških lastnosti eni najpogosteje sintetiziranih, raziskanih in uporabljenih predstavnikov tega razreda materialov.1 Na splošno velja, da se edinstvene lastnosti nanomaterialov (vključno z AgNP) pripisujejo predvsem njihovi veliki specifični površini.Zato je neizogibna težava vsak postopek, ki vpliva na to ključno lastnost, kot je velikost delcev, površinska prevleka ali agregacija, ali bo resno poškodoval lastnosti nanodelcev, ki so kritične za posebne aplikacije.
Učinki velikosti delcev in stabilizatorjev so predmeti, ki so relativno dobro dokumentirani v literaturi.Na primer, splošno sprejeto mnenje je, da so manjši nanodelci bolj strupeni kot večji nanodelci.2 V skladu s splošno literaturo so naše prejšnje študije pokazale od velikosti odvisno delovanje nanosrebra na celicah in mikroorganizmih sesalcev.3–5 Površinski premaz je še en atribut, ki močno vpliva na lastnosti nanomaterialov.Samo z dodajanjem ali spreminjanjem stabilizatorjev na njegovi površini ima lahko isti nanomaterial popolnoma drugačne fizikalne, kemične in biološke lastnosti.Uporaba zapiral se najpogosteje izvaja v okviru sinteze nanodelcev.Na primer, nanodelci srebra s citratno zaključeno so eni najpomembnejših AgNP v raziskavi, ki so sintetizirani z redukcijo srebrovih soli v izbrani raztopini stabilizatorja kot reakcijskem mediju.6 Citrat lahko zlahka izkoristi svoje nizke stroške, razpoložljivost, biokompatibilnost in močno afiniteto do srebra, kar se lahko odraža v različnih predlaganih interakcijah, od reverzibilne površinske adsorpcije do ionskih interakcij.Majhne molekule in poliatomski ioni blizu 7,8, kot so citrati, polimeri, polielektroliti in biološki agensi, se pogosto uporabljajo tudi za stabilizacijo nano-srebra in izvajanje edinstvenih funkcionalizacij na njem.9-12
Čeprav je možnost spreminjanja aktivnosti nanodelcev z namernim pokrivanjem površine zelo zanimivo področje, je glavna vloga tega površinskega premaza zanemarljiva, saj zagotavlja koloidno stabilnost sistema nanodelcev.Velika specifična površina nanomaterialov bo proizvedla veliko površinsko energijo, kar ovira termodinamično sposobnost sistema, da doseže svojo minimalno energijo.13 Brez ustrezne stabilizacije lahko to povzroči aglomeracijo nanomaterialov.Agregacija je tvorba agregatov delcev različnih oblik in velikosti, do katere pride, ko se razpršeni delci srečajo in trenutne termodinamične interakcije omogočijo, da se delci medsebojno oprimejo.Zato se stabilizatorji uporabljajo za preprečevanje agregacije z uvedbo dovolj velike odbojne sile med delce, da preprečijo njihovo termodinamično privlačnost.14
Čeprav je bila tema velikosti delcev in površinske pokritosti temeljito raziskana v kontekstu njene regulacije bioloških aktivnosti, ki jih sprožijo nanodelci, je agregacija delcev večinoma zapostavljeno področje.Skoraj ni temeljite študije za rešitev koloidne stabilnosti nanodelcev v biološko pomembnih pogojih.10,15-17 Poleg tega je ta prispevek še posebej redek, saj so preučevali tudi toksičnost, povezano z agregacijo, tudi če lahko povzroči neželene učinke, kot je vaskularna tromboza, ali izguba želenih lastnosti, kot je njegova toksičnost, npr. prikazano na sliki 1.18, 19 prikazano.Pravzaprav je eden redkih znanih mehanizmov odpornosti srebrovih nanodelcev povezan z agregacijo, ker naj bi nekateri sevi E. coli in Pseudomonas aeruginosa zmanjšali svojo občutljivost za nano srebro z izražanjem proteina flagelina, flagellina.Ima visoko afiniteto do srebra, s čimer povzroči agregacijo.20
Obstaja več različnih mehanizmov, povezanih s toksičnostjo srebrovih nanodelcev, agregacija pa vpliva na vse te mehanizme.Najbolj obravnavana metoda biološke aktivnosti AgNP, včasih imenovana tudi mehanizem »trojanskega konja«, obravnava AgNP kot nosilce Ag+.1,21 Mehanizem trojanskega konja lahko zagotovi veliko povečanje lokalne koncentracije Ag+, kar vodi do generiranja ROS in depolarizacije membrane.22-24 Agregacija lahko vpliva na sproščanje Ag+ in s tem vpliva na toksičnost, ker zmanjša učinkovito aktivno površino, kjer se srebrovi ioni lahko oksidirajo in raztopijo.Vendar pa AgNPs ne bodo pokazali toksičnosti samo zaradi sproščanja ionov.Upoštevati je treba številne interakcije, povezane z velikostjo in morfologijo.Med njimi sta velikost in oblika površine nanodelcev odločilni značilnosti.4,25 Skupek teh mehanizmov je mogoče kategorizirati kot "mehanizmi inducirane toksičnosti".Obstaja potencialno veliko mitohondrijskih in površinskih membranskih reakcij, ki lahko poškodujejo organele in povzročijo celično smrt.25-27 Ker tvorba agregatov naravno vpliva na velikost in obliko predmetov, ki vsebujejo srebro, ki jih prepoznajo živi sistemi, lahko vpliva tudi na te interakcije.
V našem prejšnjem prispevku o agregaciji srebrovih nanodelcev smo prikazali učinkovit postopek presejanja, ki je sestavljen iz kemičnih in in vitro bioloških poskusov za preučevanje tega problema.19 Dinamično sipanje svetlobe (DLS) je prednostna tehnika za te vrste pregledov, ker lahko material sipa fotone pri valovni dolžini, ki je primerljiva z velikostjo njegovih delcev.Ker je Brownova hitrost gibanja delcev v tekočem mediju povezana z velikostjo, lahko spremembo intenzivnosti razpršene svetlobe uporabimo za določitev povprečnega hidrodinamičnega premera (Z-mean) tekočega vzorca.28 Poleg tega lahko z uporabo napetosti na vzorec izmerimo zeta potencial (ζ potencial) nanodelcev podobno kot povprečna vrednost Z.13,28 Če je absolutna vrednost potenciala zeta dovolj visoka (v skladu s splošnimi smernicami> ±30 mV), bo ustvarila močno elektrostatično odbojnost med delci, ki bo preprečila agregacijo.Značilna površinska plazmonska resonanca (SPR) je edinstven optični pojav, ki ga v glavnem pripisujemo nanodelcem plemenitih kovin (predvsem Au in Ag).29​​ Na podlagi elektronskih nihanj (površinskih plazmonov) teh materialov na nanometru je znano, da imajo sferični AgNP-ji značilen vrh absorpcije UV-Vis blizu 400 nm.30 Intenzivnost in premik valovne dolžine delcev se uporabljata za dopolnitev rezultatov DLS, saj se ta metoda lahko uporablja za odkrivanje agregacije nanodelcev in površinske adsorpcije biomolekul.
Na podlagi pridobljenih informacij se izvajajo testi celične viabilnosti (MTT) in antibakterijski testi na način, pri katerem je toksičnost AgNP opisana kot funkcija ravni agregacije, namesto (najpogosteje uporabljenega faktorja) koncentracije nanodelcev.Ta edinstvena metoda nam omogoča, da dokažemo velik pomen ravni agregacije v biološki aktivnosti, ker na primer AgNP s citratno končano stranjo popolnoma izgubijo svojo biološko aktivnost v nekaj urah zaradi agregacije.19
V trenutnem delu želimo močno razširiti naše prejšnje prispevke na področju stabilnosti bioloških koloidov in njihovega vpliva na biološko aktivnost s proučevanjem učinka velikosti nanodelcev na agregacijo nanodelcev.To je nedvomno ena od raziskav nanodelcev.Perspektiva višjega profila in 31 Da bi raziskali to težavo, je bila uporabljena metoda rasti, posredovana s semeni, za proizvodnjo AgNP-jev s citratno končano stranjo v treh različnih velikostih (10, 20 in 50 nm).6,32 kot eno najpogostejših metod.Za nanomateriale, ki se pogosto in rutinsko uporabljajo v medicinskih aplikacijah, so izbrani AgNP-ji različnih velikosti s citratno zaključeno plastjo za preučevanje možne odvisnosti od velikosti bioloških lastnosti nanosrebra, povezanih z agregacijo.Po sintetiziranju AgNP različnih velikosti smo proizvedene vzorce okarakterizirali s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) in nato delce pregledali z zgoraj omenjenim postopkom presejanja.Poleg tega so v prisotnosti in vitro celičnih kultur Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) in fetalnega govejega seruma (FBS) ovrednotili od velikosti odvisno agregacijsko obnašanje in njegovo obnašanje pri različnih vrednostih pH, ​​NaCl, koncentracijah glukoze in glutamina.Značilnosti citotoksičnosti se določijo pod celovitimi pogoji.Znanstveno soglasje kaže, da so na splošno bolj zaželeni manjši delci;naša preiskava zagotavlja kemično in biološko platformo za ugotavljanje, ali je temu tako.
Trije srebrovi nanodelci z različnimi razponi velikosti so bili pripravljeni z metodo rasti, posredovane s semeni, ki so jo predlagali Wan et al., z rahlimi prilagoditvami.6 Ta metoda temelji na kemični redukciji z uporabo srebrovega nitrata (AgNO3) kot vira srebra, natrijevega borohidrida (NaBH4) kot reducenta in natrijevega citrata kot stabilizatorja.Najprej pripravite 75 mL 9 mM vodne raztopine citrata iz natrijevega citrata dihidrata (Na3C6H5O7 x 2H2O) in segrejte na 70 °C.Nato smo v reakcijski medij dodali 2 mL 1 % m/v raztopine AgNO3 in nato v mešanico po kapljicah vlili sveže pripravljeno raztopino natrijevega borohidrida (2 mL 0,1 % m/v).Nastalo rumeno-rjavo suspenzijo vzdržujemo pri 70 °C ob močnem mešanju 1 uro in nato ohladimo na sobno temperaturo.Nastali vzorec (odslej imenovan AgNP-I) se uporablja kot osnova za rast, posredovano s semeni, v naslednjem koraku sinteze.
Za sintetiziranje srednje velike suspenzije delcev (označene kot AgNP-II) segrejte 90 ml 7,6 mM raztopine citrata na 80 °C, jo zmešajte z 10 ml AgNP-I in nato zmešajte 2 ml 1 % m/v raztopine AgNO3. vzdržujemo pri močnem mehanskem mešanju 1 uro, nato pa vzorec ohladimo na sobno temperaturo.
Za največji delec (AgNP-III) ponovite isti postopek rasti, vendar v tem primeru uporabite 10 ml AgNP-II kot suspenzijo semena.Ko vzorci dosežejo sobno temperaturo, nastavijo nominalno koncentracijo Ag na podlagi celotne vsebnosti AgNO3 na 150 ppm z dodajanjem ali izhlapevanjem dodatnega topila pri 40 °C in jih nazadnje shranijo pri 4 °C do nadaljnje uporabe.
Uporabite transmisijski elektronski mikroskop FEI Tecnai G2 20 X-Twin (TEM) (sedež podjetja FEI, Hillsboro, Oregon, ZDA) s pospeševalno napetostjo 200 kV, da preučite morfološke značilnosti nanodelcev in zajamete njihov vzorec elektronske difrakcije (ED).Vsaj 15 reprezentativnih slik (~750 delcev) je bilo ovrednotenih s programskim paketom ImageJ, dobljeni histogrami (in vsi grafi v celotni študiji) pa so bili ustvarjeni v OriginPro 2018 (OriginLab, Northampton, MA, ZDA) 33, 34.
Za ponazoritev njihovih začetnih koloidnih lastnosti so bili izmerjeni povprečni hidrodinamični premer (Z-povprečje), zeta potencial (ζ-potencial) in značilna površinska plazmonska resonanca (SPR).Povprečni hidrodinamični premer in zeta potencial vzorca sta bila izmerjena z instrumentom Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, Združeno kraljestvo) z uporabo prepognjenih kapilarnih celic za enkratno uporabo pri 37 ± 0,1 °C.UV-Vis spektrofotometer Ocean Optics 355 DH-2000-BAL (Halma PLC, Largo, FL, ZDA) je bil uporabljen za pridobitev značilnih SPR karakteristik iz UV-Vis absorpcijskih spektrov vzorcev v območju 250-800 nm.
Med celotnim poskusom so bile hkrati izvedene tri različne vrste meritev, povezane s koloidno stabilnostjo.Uporabite DLS za merjenje povprečnega hidrodinamičnega premera (povprečje Z) in potenciala zeta (potencial ζ) delcev, ker je povprečje Z povezano s povprečno velikostjo agregatov nanodelcev, potencial zeta pa kaže, ali je elektrostatični odboj v sistemu je dovolj močna, da izravna Van der Waalsovo privlačnost med nanodelci.Meritve se opravijo v treh izvodih, standardna deviacija povprečja Z in zeta potenciala pa se izračuna s programsko opremo Zetasizer.Značilni SPR spektri delcev so ovrednoteni z UV-Vis spektroskopijo, ker lahko spremembe največje intenzivnosti in valovne dolžine kažejo na agregacijo in površinske interakcije.29,35 Dejansko je površinska plazmonska resonanca v plemenitih kovinah tako vplivna, da je privedla do novih metod analize biomolekul.29,36,37 Koncentracija AgNP v eksperimentalni mešanici je približno 10 ppm, namen pa je nastaviti intenzivnost največje začetne absorpcije SPR na 1. Poskus je bil izveden na časovno odvisen način pri 0;1,5;3;6;12 in 24 ur pod različnimi biološko pomembnimi pogoji.Več podrobnosti, ki opisujejo poskus, je na voljo v našem prejšnjem delu.19 Skratka, različne vrednosti pH (3; 5; 7,2 in 9), različne koncentracije natrijevega klorida (10 mM; 50 mM; 150 mM), glukoze (3,9 mM; 6,7 mM) in glutamina (4 mM) ter pripravili tudi Dulbeccov modificiran Eagle Medium (DMEM) in fetalni goveji serum (FBS) (v vodi in DMEM) kot modelna sistema ter proučevali njune učinke na agregacijsko obnašanje sintetiziranih srebrovih nanodelcev.pH Vrednosti NaCl, glukoze in glutamina so ovrednotene na podlagi fizioloških koncentracij, medtem ko sta količini DMEM in FBS enaki kot ravni, uporabljeni v celotnem poskusu in vitro.38-42 Vse meritve so bile izvedene pri pH 7,2 in 37 °C s konstantno koncentracijo soli v ozadju 10 mM NaCl, da se odpravijo morebitne interakcije delcev na dolge razdalje (razen pri nekaterih poskusih, povezanih s pH in NaCl, kjer so ti atributi spremenljivke pod študij).28 Seznam različnih pogojev je povzet v tabeli 1. Poskus, označen z †, se uporablja kot referenca in ustreza vzorcu, ki vsebuje 10 mM NaCl in pH 7,2.
Celična linija človeškega raka prostate (DU145) in ovekovečeni človeški keratinociti (HaCaT) so bili pridobljeni iz ATCC (Manassas, VA, ZDA).Celice se rutinsko gojijo v Dulbeccovem minimalnem esencialnem mediju Eagle (DMEM), ki vsebuje 4,5 g/L glukoze (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, ZDA), dopolnjenem z 10 % FBS, 2 mM L-glutamina, 0,01 % Streptomicina in 0,005 % Penicilin (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, ZDA).Celice gojimo v inkubatorju pri 37 °C pri 5 % CO2 in 95 % vlažnosti.
Da bi raziskali spremembe citotoksičnosti AgNP, ki jih povzroča agregacija delcev na časovno odvisen način, je bil izveden dvostopenjski MTT test.Najprej je bila izmerjena sposobnost preživetja obeh tipov celic po zdravljenju z AgNP-I, AgNP-II in AgNP-III.V ta namen sta bili dve vrsti celic posejani v plošče s 96 vdolbinicami z gostoto 10.000 celic/vdolbinico in obdelani s tremi različnimi velikostmi srebrovih nanodelcev v naraščajočih koncentracijah drugi dan.Po 24 urah obdelave smo celice sprali s PBS in inkubirali z 0,5 mg/mL reagenta MTT (SERVA, Heidelberg, Nemčija), razredčenega v gojišču 1 uro pri 37 °C.Kristale formazana smo raztopili v DMSO (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, ZDA) in izmerili absorpcijo pri 570 nm z uporabo bralnika plošč Synergy HTX (BioTek-Madžarska, Budimpešta, Madžarska).Vrednost absorpcije neobdelanega kontrolnega vzorca velja za 100-odstotno stopnjo preživetja.Izvedite vsaj 3 poskuse z uporabo štirih neodvisnih bioloških ponovitev.IC50 se izračuna iz krivulje odziva na odmerek na podlagi rezultatov vitalnosti.
Nato smo v drugem koraku z inkubacijo delcev s 150 mM NaCl za različna časovna obdobja (0, 1,5, 3, 6, 12 in 24 ur) pred obdelavo celic proizvedli različna agregacijska stanja srebrovih nanodelcev.Nato je bil izveden isti test MTT, kot je opisano prej, da bi ocenili spremembe v viabilnosti celic, na katere vpliva agregacija delcev.Uporabite GraphPad Prism 7 za ovrednotenje končnega rezultata, izračunajte statistično pomembnost poskusa z neparnim t-testom in označite njegovo raven z * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01), *** (p ≤ 0,001). ) In **** (p ≤ 0,0001).
Tri različne velikosti srebrovih nanodelcev (AgNP-I, AgNP-II in AgNP-III) so bile uporabljene za antibakterijsko občutljivost na Cryptococcus neoformans IFM 5844 (IFM; Raziskovalni center za patogene glive in mikrobno toksikologijo, Univerza Chiba) in Bacillus Test megaterium SZMC 6031 (SZMC: Szeged Microbiology Collection) in E. coli SZMC 0582 v gojišču RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Co.).Da bi ocenili spremembe protibakterijske aktivnosti, ki jih povzroča agregacija delcev, smo najprej določili njihovo minimalno inhibitorno koncentracijo (MIC) z mikrodilucijo v mikrotitrski plošči s 96 jamicami.V 50 μL standardizirane celične suspenzije (5 × 104 celic/mL v mediju RPMI 1640) dodamo 50 μL suspenzije srebrovih nanodelcev in serijsko razredčimo dvakratno koncentracijo (v zgoraj omenjenem mediju je območje 0 in 75 ppm, tj. kontrolni vzorec vsebuje 50 μL celične suspenzije in 50 μL medija brez nanodelcev).Nato smo ploščo inkubirali pri 30 °C 48 ur in izmerili optično gostoto kulture pri 620 nm z uporabo bralnika plošč SPECTROstar Nano (BMG LabTech, Offenburg, Nemčija).Poskus smo izvedli trikrat v trojniku.
Razen tega, da je bilo v tem času uporabljenih 50 μL posameznih agregiranih vzorcev nanodelcev, je bil za preučevanje učinka agregacije na protibakterijsko aktivnost na prej omenjenih sevih uporabljen enak postopek, kot je bil prej opisan.Različna agregacijska stanja nanodelcev srebra nastanejo z inkubacijo delcev s 150 mM NaCl za različna časovna obdobja (0, 1,5, 3, 6, 12 in 24 ur) pred obdelavo celic.Za kontrolo rasti smo uporabili suspenzijo, dopolnjeno s 50 μL medija RPMI 1640, za kontrolo toksičnosti pa suspenzijo z neagregiranimi nanodelci.Poskus smo izvedli trikrat v trojniku.Uporabite GraphPad Prism 7, da znova ocenite končni rezultat z uporabo iste statistične analize kot analiza MTT.
Okarakterizirana je agregacijska stopnja najmanjših delcev (AgNP-I), rezultati so bili delno objavljeni v prejšnjem delu, vendar smo za boljšo primerjavo vse delce temeljito pregledali.Eksperimentalni podatki so zbrani in obravnavani v naslednjih razdelkih.Tri velikosti AgNP.19
Meritve, izvedene s TEM, UV-Vis in DLS, so potrdile uspešno sintezo vseh vzorcev AgNP (slika 2A-D).Glede na prvo vrstico slike 2 ima najmanjši delec (AgNP-I) enakomerno sferično morfologijo s povprečnim premerom približno 10 nm.Metoda rasti s semeni zagotavlja tudi AgNP-II in AgNP-III z različnimi razponi velikosti s povprečnim premerom delcev približno 20 nm oziroma 50 nm.Glede na standardno deviacijo porazdelitve delcev se velikosti treh vzorcev ne prekrivajo, kar je pomembno za njihovo primerjalno analizo.S primerjavo povprečnega razmerja stranic in razmerja tankosti 2D projekcij delcev na osnovi TEM se domneva, da je sferičnost delcev ovrednotena z vtičnikom filtra oblike ImageJ (slika 2E).43 Glede na analizo oblike delcev rast delcev ne vpliva na njihovo razmerje stranic (velika stranica/krajša stranica najmanjšega omejevalnega pravokotnika) in razmerje njihove tankosti (izmerjena površina ustreznega popolnega kroga/teoretična površina). ) se postopoma zmanjšuje.Posledica tega je vse več poliedrskih delcev, ki so teoretično popolnoma okrogli, kar ustreza razmerju tankosti 1.
Slika 2 Slika s transmisijskim elektronskim mikroskopom (TEM) (A), vzorec elektronske difrakcije (ED) (B), histogram porazdelitve velikosti (C), značilen ultravijolično-vidni (UV-Vis) absorpcijski spekter svetlobe (D) in povprečni tekočinski citrat -terminirani nanodelci srebra z mehanskim premerom (Z-povprečje), zeta potencialom, razmerjem stranic in razmerjem debeline (E) imajo tri različne velikosti: AgNP-I je 10 nm (zgornja vrstica), AgNP -II je 20 nm (srednja vrstica) ), AgNP-III (spodnja vrstica) je 50 nm.
Čeprav je ciklična narava metode rasti do neke mere vplivala na obliko delcev, kar je povzročilo manjšo sferičnost večjih AgNP, so vsi trije vzorci ostali kvazisferični.Poleg tega, kot je prikazano v vzorcu elektronske difrakcije na sliki 2B, nano kristaliničnost delcev ni prizadeta.Izrazit uklonski obroč, ki ga je mogoče povezati z Millerjevimi indeksi (111), (220), (200) in (311) srebra, je zelo skladen z znanstveno literaturo in našimi prejšnjimi prispevki.9, 19,44 Fragmentacija Debye-Scherrerjevega obroča AgNP-II in AgNP-III je posledica dejstva, da je slika ED zajeta pri enaki povečavi, tako da se z večanjem velikosti delcev število difraktiranih delcev na površina enote se povečuje in zmanjšuje.
Znano je, da velikost in oblika nanodelcev vplivata na biološko aktivnost.3,45 Katalitično in biološko aktivnost, odvisno od oblike, je mogoče razložiti z dejstvom, da različne oblike težijo k razmnoževanju določenih kristalnih ploskev (z različnimi Millerjevimi indeksi), te kristalne ploskve pa imajo različne aktivnosti.45,46 Ker pripravljeni delci zagotavljajo podobne rezultate ED, ki ustrezajo zelo podobnim kristalnim značilnostim, lahko domnevamo, da je treba v naših poznejših poskusih koloidne stabilnosti in biološke aktivnosti vse opažene razlike pripisati velikosti nanodelcev, ne lastnostim, povezanim z obliko.
Rezultati UV-Vis, povzeti na sliki 2D, dodatno poudarjajo izjemno sferično naravo sintetiziranega AgNP, ker so vrhovi SPR vseh treh vzorcev okoli 400 nm, kar je značilna vrednost sferičnih srebrovih nanodelcev.29,30 Zajeti spektri so potrdili tudi uspešno rast nanosrebra, posredovano s semeni.Ko se velikost delcev povečuje, je valovna dolžina, ki ustreza največji absorpciji svetlobe AgNP-II, bolj izrazita. Glede na literaturo je AgNP-III doživel rdeči premik.6,29
Kar zadeva začetno koloidno stabilnost sistema AgNP, je bil DLS uporabljen za merjenje povprečnega hidrodinamičnega premera in zeta potenciala delcev pri pH 7,2.Rezultati, prikazani na sliki 2E, kažejo, da ima AgNP-III večjo koloidno stabilnost kot AgNP-I ali AgNP-II, ker skupne smernice kažejo, da je za dolgoročno koloidno stabilnost potreben zeta potencial 30 mV absolutno. Ta ugotovitev je nadalje podprta, ko povprečna vrednost Z (dobljena kot povprečni hidrodinamični premer prostih in agregiranih delcev) se primerja s primarno velikostjo delcev, pridobljeno s TEM, ker bližje kot sta si obe vrednosti, nižja je stopnja Gather v vzorcu.Dejansko je povprečje Z za AgNP-I in AgNP-II razumno višje od njihove glavne velikosti delcev, ocenjene s TEM, zato je v primerjavi z AgNP-III predvideno, da bodo ti vzorci bolj verjetno agregirani, kjer je zelo negativen zeta potencial spremlja povprečna vrednost Z blizu velikosti.
Razlaga tega pojava je lahko dvojna.Po eni strani se koncentracija citrata vzdržuje na podobni ravni v vseh korakih sinteze, kar zagotavlja relativno veliko količino nabitih površinskih skupin, da se prepreči zmanjšanje specifične površine rastočih delcev.Vendar pa je po mnenju Levak et al. mogoče majhne molekule, kot je citrat, enostavno zamenjati z biomolekulami na površini nanodelcev.V tem primeru bo koloidno stabilnost določila korona proizvedenih biomolekul.31 Ker je bilo to vedenje opaženo tudi pri naših meritvah agregacije (o katerih bomo podrobneje razpravljali kasneje), samo omejevanje citratov ne more pojasniti tega pojava.
Po drugi strani pa je velikost delcev obratno sorazmerna s tendenco agregacije na nanometrski ravni.To je v glavnem podprto s tradicionalno metodo Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO), kjer je privlačnost delcev opisana kot vsota privlačnih in odbojnih sil med delci.Po He et al. se največja vrednost energijske krivulje DLVO zmanjšuje z velikostjo nanodelcev v nanodelcih hematita, zaradi česar je lažje doseči minimalno primarno energijo, s čimer se spodbuja ireverzibilna agregacija (kondenzacija).47 Vendar se špekulira, da obstajajo drugi vidiki, ki presegajo omejitve teorije DLVO.Čeprav sta van der Waalsova gravitacija in elektrostatični dvoslojni odboj podobna z naraščajočo velikostjo delcev, pregled Hotze et al.predlaga, da ima močnejši učinek na združevanje, kot dovoljuje DLVO.14 Menijo, da površinske ukrivljenosti nanodelcev ni več mogoče oceniti kot ravno površino, zaradi česar je matematična ocena neuporabna.Poleg tega, ko se velikost delcev zmanjša, odstotek atomov, prisotnih na površini, postane višji, kar vodi do elektronske strukture in površinskega naboja.In spremeni se površinska reaktivnost, kar lahko vodi do zmanjšanja naboja v dvojni električni plasti in spodbuja agregacijo.
Pri primerjavi rezultatov DLS za AgNP-I, AgNP-II in AgNP-III na sliki 3 smo opazili, da so vsi trije vzorci pokazali podoben pH, ki spodbuja agregacijo.Močno kislo okolje (pH 3) premakne zeta potencial vzorca na 0 mV, zaradi česar delci tvorijo agregate mikronske velikosti, medtem ko alkalni pH premakne svoj zeta potencial na večjo negativno vrednost, kjer delci tvorijo manjše agregate (pH 5). ).In 7.2) ), ali ostanejo popolnoma neagregirani (pH 9).Opažene so bile tudi nekatere pomembne razlike med različnimi vzorci.V celotnem poskusu se je izkazalo, da je AgNP-I najbolj občutljiv na spremembe zeta potenciala, ki jih povzroči pH, ker je bil zeta potencial teh delcev zmanjšan pri pH 7,2 v primerjavi s pH 9, medtem ko sta AgNP-II in AgNP-III pokazala le A znatna sprememba ζ je okoli pH 3. Poleg tega je AgNP-II pokazal počasnejše spremembe in zmeren potencial zeta, medtem ko je AgNP-III pokazal najblažje obnašanje od treh, ker je sistem pokazal najvišjo absolutno vrednost zeta in počasno gibanje trenda, kar kaže na AgNP-III Najbolj odporen na agregacijo, ki jo povzroči pH.Ti rezultati so skladni z rezultati meritev povprečnega hidrodinamičnega premera.Glede na velikost delcev njunih primerjev je AgNP-I pokazal konstantno postopno agregacijo pri vseh vrednostih pH, ​​najverjetneje zaradi 10 mM NaCl ozadja, medtem ko sta AgNP-II in AgNP-III pokazala pomembno le pri pH 3 zbiranja.Najbolj zanimiva razlika je v tem, da kljub veliki velikosti nanodelcev AgNP-III tvori najmanjše agregate pri pH 3 v 24 urah, kar poudarja njegove protiagregacijske lastnosti.Če povprečni Z AgNP-jev pri pH 3 po 24 urah delimo z vrednostjo pripravljenega vzorca, lahko opazimo, da so se relativne velikosti agregatov AgNP-I in AgNP-II povečale za 50-krat, 42-krat in 22-krat. , oz.III.
Slika 3 Rezultati dinamičnega sipanja svetlobe vzorca srebrovih nanodelcev s citratnim koncem z naraščajočo velikostjo (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II in 50 nm: AgNP-III) so izraženi kot povprečni hidrodinamični premer (povprečje Z ) (desno) Pri različnih pH pogojih se zeta potencial (levo) spremeni v 24 urah.
Opažena od pH odvisna agregacija je vplivala tudi na značilno površinsko plazmonsko resonanco (SPR) vzorcev AgNP, kar dokazujejo njihovi spektri UV-Vis.Glede na dodatno sliko S1 agregaciji vseh treh suspenzij srebrovih nanodelcev sledi zmanjšanje intenzivnosti njihovih vrhov SPR in zmeren rdeči premik.Obseg teh sprememb kot funkcija pH je skladen s stopnjo agregacije, predvideno z rezultati DLS, vendar so opazili nekaj zanimivih trendov.V nasprotju z intuicijo se izkaže, da je na spremembe SPR najbolj občutljiv srednje velik AgNP-II, medtem ko sta druga dva vzorca manj občutljiva.V raziskavah SPR je 50 nm teoretična meja velikosti delcev, ki se uporablja za razlikovanje delcev na podlagi njihovih dielektričnih lastnosti.Delce, manjše od 50 nm (AgNP-I in AgNP-II), lahko opišemo kot preproste dielektrične dipole, medtem ko imajo delci, ki dosežejo ali presežejo to mejo (AgNP-III), kompleksnejše dielektrične lastnosti in njihova resonanca Pas se razcepi na večmodalne spremembe. .V primeru dveh manjših vzorcev delcev lahko AgNP obravnavamo kot preproste dipole in plazma se zlahka prekriva.Ko se velikost delcev poveča, ta sklopitev v bistvu proizvede večjo plazmo, kar lahko pojasni opazovano večjo občutljivost.29 Vendar pa za največje delce preprosta dipolna ocena ni veljavna, če se lahko pojavijo tudi druga stanja sklopitve, kar lahko pojasni zmanjšano težnjo AgNP-III, da kaže spektralne spremembe.29
V naših eksperimentalnih pogojih je dokazano, da pH vrednost močno vpliva na koloidno stabilnost srebrovih nanodelcev različnih velikosti s citratom.V teh sistemih stabilnost zagotavljajo negativno nabite skupine -COO- na površini AgNP.Karboksilatna funkcionalna skupina citratnega iona je protonirana v velikem številu ionov H+, zato ustvarjena karboksilna skupina ne more več zagotavljati elektrostatičnega odbijanja med delci, kot je prikazano v zgornji vrstici slike 4. V skladu z Le Chatelierjevim načelom AgNP vzorci se hitro združijo pri pH 3, vendar postopoma postajajo vedno bolj stabilni, ko se pH povečuje.
Slika 4 Shematski mehanizem površinske interakcije, definiran z agregacijo pri različnih pH (zgornja vrstica), koncentraciji NaCl (srednja vrstica) in biomolekulah (spodnja vrstica).
Glede na sliko 5 je bila koloidna stabilnost v suspenzijah AgNP različnih velikosti preučena tudi pri naraščajočih koncentracijah soli.Na podlagi zeta potenciala povečana velikost nanodelcev v teh sistemih AgNP s citratno zaključeno ponovno zagotavlja večjo odpornost na zunanje vplive NaCl.V AgNP-I zadostuje 10 mM NaCl, da inducira blago agregacijo, koncentracija soli 50 mM pa daje zelo podobne rezultate.Pri AgNP-II in AgNP-III 10 mM NaCl ne vpliva bistveno na zeta potencial, ker njune vrednosti ostajajo pri (AgNP-II) ali pod (AgNP-III) -30 mV.Povečanje koncentracije NaCl na 50 mM in končno na 150 mM NaCl zadostuje za znatno zmanjšanje absolutne vrednosti zeta potenciala v vseh vzorcih, čeprav večji delci ohranijo več negativnega naboja.Ti rezultati so skladni s pričakovanim povprečnim hidrodinamičnim premerom AgNPs;povprečne trendne črte Z, izmerjene na 10, 50 in 150 mM NaCl, kažejo različne, postopno naraščajoče vrednosti.Končno so bili v vseh treh 150 mM poskusih odkriti agregati mikronske velikosti.
Slika 5 Rezultati dinamičnega sipanja svetlobe vzorca srebrovih nanodelcev s citratnim koncem z naraščajočo velikostjo (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II in 50 nm: AgNP-III) so izraženi kot povprečni hidrodinamični premer (povprečje Z ) (desno) in zeta potencial (levo) se spremenita v 24 urah pod različnimi koncentracijami NaCl.
Rezultati UV-Vis na dodatni sliki S2 kažejo, da ima SPR 50 in 150 mM NaCl v vseh treh vzorcih takojšnje in znatno zmanjšanje.To je mogoče razložiti z DLS, ker se agregacija na osnovi NaCl zgodi hitreje kot poskusi, odvisni od pH, kar je razloženo z veliko razliko med zgodnjimi (0, 1,5 in 3 ure) meritvami.Poleg tega bo povečanje koncentracije soli povečalo tudi relativno prepustnost eksperimentalnega medija, kar bo močno vplivalo na površinsko plazmonsko resonanco.29
Učinek NaCl je povzet v srednji vrstici slike 4. Na splošno lahko sklepamo, da ima povečanje koncentracije natrijevega klorida podoben učinek kot povečanje kislosti, ker se ioni Na+ nagibajo k koordinaciji okoli karboksilatnih skupin, zatiranje AgNP negativnega zeta potenciala.Poleg tega je 150 mM NaCl proizvedlo mikronske agregate v vseh treh vzorcih, kar kaže, da fiziološka koncentracija elektrolita škoduje koloidni stabilnosti citratno zaključenih AgNP.Z upoštevanjem kritične kondenzacijske koncentracije (CCC) NaCl na podobnih sistemih AgNP lahko te rezultate pametno umestimo v ustrezno literaturo.Huynh et al.izračunali, da je CCC NaCl za nanodelce srebra s citratno zaključeno povprečnim premerom 71 nm 47,6 mM, medtem ko El Badawy et al.opazili, da je bil CCC 10 nm AgNP s citratno prevleko 70 mM.10,16 Poleg tega so He et al. izmerili znatno visok CCC približno 300 mM, zaradi česar se je njihova metoda sinteze razlikovala od prej omenjene objave.48 Čeprav trenutni prispevek ni namenjen celoviti analizi teh vrednosti, ker se naši eksperimentalni pogoji povečujejo zaradi kompleksnosti celotne študije, se zdi biološko pomembna koncentracija NaCl 50 mM, zlasti 150 mM NaCl, precej visoka.Inducirana koagulacija, ki pojasnjuje zaznane močne spremembe.
Naslednji korak v poskusu polimerizacije je uporaba preprostih, a biološko pomembnih molekul za simulacijo interakcij nanodelcev in biomolekul.Na podlagi rezultatov DLS (sliki 6 in 7) in UV-Vis (dodatni sliki S3 in S4) je mogoče potrditi nekaj splošnih zaključkov.V naših eksperimentalnih pogojih proučevani molekuli glukoze in glutamina ne bosta povzročili agregacije v nobenem sistemu AgNP, ker je trend Z-povprečja tesno povezan z ustrezno referenčno vrednostjo meritev.Čeprav njihova prisotnost ne vpliva na agregacijo, eksperimentalni rezultati kažejo, da so te molekule delno adsorbirane na površini AgNP.Najvidnejši rezultat, ki podpira to mnenje, je opažena sprememba absorpcije svetlobe.Čeprav AgNP-I ne kaže pomembnih sprememb valovne dolžine ali intenzitete, ga je mogoče jasneje opazovati z merjenjem večjih delcev, kar je najverjetneje posledica prej omenjene večje optične občutljivosti.Ne glede na koncentracijo lahko glukoza povzroči večji rdeči premik po 1,5 ure v primerjavi s kontrolno meritvijo, ki je približno 40 nm v AgNP-II in približno 10 nm v AgNP-III, kar dokazuje pojav površinskih interakcij.Glutamin je pokazal podoben trend, vendar sprememba ni bila tako očitna.Poleg tega je treba omeniti tudi, da lahko glutamin zmanjša absolutni zeta potencial srednjih in velikih delcev.Ker pa se zdi, da te zeta spremembe ne vplivajo na stopnjo agregacije, lahko ugibamo, da lahko tudi majhne biomolekule, kot je glutamin, zagotovijo določeno stopnjo prostorskega odbijanja med delci.
Slika 6 Rezultati dinamičnega sipanja svetlobe vzorcev srebrovih nanodelcev s citratnim koncem z naraščajočo velikostjo (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II in 50 nm: AgNP-III) so izraženi kot povprečni hidrodinamični premer (povprečje Z) (desno) Pri zunanjih pogojih različnih koncentracij glukoze se zeta potencial (levo) spremeni v 24 urah.
Slika 7 Rezultati dinamičnega sipanja svetlobe vzorca srebrovih nanodelcev s citratnim koncem z naraščajočo velikostjo (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II in 50 nm: AgNP-III) so izraženi kot povprečni hidrodinamični premer (povprečje Z ) (desno) V prisotnosti glutamina se zeta potencial (levo) spremeni v 24 urah.
Skratka, majhne biomolekule, kot sta glukoza in glutamin, ne vplivajo na koloidno stabilnost pri izmerjeni koncentraciji: čeprav v različni meri vplivajo na potencial zeta in rezultate UV-Vis, povprečni rezultati Z niso dosledni.To kaže, da površinska adsorpcija molekul zavira elektrostatično odbojnost, hkrati pa zagotavlja dimenzijsko stabilnost.
Da bi prejšnje rezultate povezali s prejšnjimi in spretneje simulirali biološke razmere, smo izbrali nekaj najpogosteje uporabljenih komponent celične kulture in jih uporabili kot eksperimentalne pogoje za preučevanje stabilnosti koloidov AgNP.V celotnem poskusu in vitro je ena najpomembnejših funkcij DMEM kot medija vzpostavitev potrebnih osmotskih pogojev, s kemijskega vidika pa gre za kompleksno raztopino soli s skupno ionsko močjo, podobno 150 mM NaCl. .40 Kar zadeva FBS, je to kompleksna mešanica biomolekul-predvsem proteinov-z vidika površinske adsorpcije ima nekaj podobnosti z eksperimentalnimi rezultati glukoze in glutamina, kljub kemijski sestavi in ​​raznolikosti Spol je veliko bolj zapleten.19 DLS in UV-vidne rezultate, prikazane na sliki 8 oziroma na dodatni sliki S5, je mogoče pojasniti s preučevanjem kemične sestave teh materialov in njihovo korelacijo z meritvami v prejšnjem razdelku.
Slika 8 Rezultati dinamičnega sipanja svetlobe vzorca srebrovih nanodelcev s citratnim koncem z naraščajočo velikostjo (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II in 50 nm: AgNP-III) so izraženi kot povprečni hidrodinamični premer (povprečje Z ) (desno) V prisotnosti komponent celične kulture DMEM in FBS se zeta potencial (levo) spremeni v 24 urah.
Redčenje AgNP različnih velikosti v DMEM ima podoben učinek na koloidno stabilnost kot tisti, opažen v prisotnosti visokih koncentracij NaCl.Disperzija AgNP v 50 v/v % DMEM je pokazala, da je bila zaznana obsežna agregacija s povečanjem zeta potenciala in Z-povprečne vrednosti ter močnim zmanjšanjem intenzivnosti SPR.Omeniti velja, da je največja velikost agregata, ki jo povzroči DMEM po 24 urah, obratno sorazmerna z velikostjo nanodelcev primerja.
Interakcija med FBS in AgNP je podobna tisti, ki jo opazimo v prisotnosti manjših molekul, kot sta glukoza in glutamin, vendar je učinek močnejši.Povprečje Z delcev ostane nespremenjeno, medtem ko je zaznano povečanje zeta potenciala.Vrh SPR je pokazal rahel rdeč premik, a morda bolj zanimivo je, da se intenzivnost SPR ni zmanjšala tako pomembno kot pri kontrolni meritvi.Te rezultate je mogoče razložiti s prirojeno adsorpcijo makromolekul na površini nanodelcev (spodnja vrstica na sliki 4), ki jo zdaj razumemo kot tvorbo biomolekularne korone v telesu.49