Javascript er nú óvirkt í vafranum þínum.Þegar javascript er óvirkt munu sumar aðgerðir þessarar vefsíðu ekki virka.
Skráðu tilteknar upplýsingar þínar og tiltekin lyf sem þú hefur áhuga á, og við munum passa upplýsingarnar sem þú gefur upp við greinar í víðtæka gagnagrunninum okkar og senda þér PDF afrit með tölvupósti tímanlega.
Eru smærri nanóagnir alltaf betri?Skilja líffræðileg áhrif stærðarháðrar samsöfnunar silfurnanóagna við líffræðilega viðeigandi aðstæður
Höfundar: Bélteky P, Rónavári A, Zakupszky D, Boka E, Igaz N, Szerencsés B, Pfeiffer I, Vágvölgyi C, Kiricsi M, Kónya Z
Péter Bélteky,1,* Andrea Rónavári,1,* Dalma Zakupszky,1 Eszter Boka,1 Nóra Igaz,2 Bettina Szerencsés,3 Ilona Pfeiffer,3 Csaba Vágvölgyi,3 Mónika Kiricsi í umhverfisefnafræði, Ungverjalandi, vísinda- og upplýsingafræðideild Ungverjalands. , Háskólinn í Szeged;2 Lífefnafræði- og sameindalíffræðideild, Vísinda- og upplýsingadeild, Háskólinn í Szeged, Ungverjalandi;3 Örverufræðideild, Vísinda- og upplýsingadeild, Háskólinn í Szeged, Ungverjalandi;4MTA-SZTE Reaction Kinetics and Surface Chemistry Research Group, Szeged, Ungverjalandi* Þessir höfundar lögðu jafnt sitt af mörkum til þessarar vinnu.Samskipti: Zoltán Kónya Department of Applied and Environmental Chemistry, Vísinda- og upplýsingafræðideild, University of Szeged, Rerrich Square 1, Szeged, H-6720, Ungverjaland Sími +36 62 544620 Netfang [Tölvuvörn] Tilgangur: Silfur nanóagnir (AgNP) eru eitt algengasta nanóefnið, sérstaklega vegna lífeðlisfræðilegra nota þeirra.Hins vegar, vegna samsöfnunar nanóagna, eru framúrskarandi frumueiturhrif þeirra og bakteríudrepandi virkni oft í hættu í líffræðilegum miðlum.Í þessari vinnu var samsöfnunarhegðun og tengd líffræðileg virkni þriggja mismunandi sítratlokaðra silfurnanóagnasýna með meðalþvermál 10, 20 og 50 nm rannsakað.Aðferð: Notaðu rafeindasmásjá til að búa til og einkenna nanóagnir, meta samsöfnunarhegðun þeirra við mismunandi pH gildi, NaCl, glúkósa og glútamín styrk með kraftmikilli ljósdreifingu og útfjólubláum sýnilegri litrófsgreiningu.Að auki, í frumuræktunarmiðlinum, bæta þættir eins og Dulbecco söfnunarhegðun í Eagle Medium og Fetal Calf Serum.Niðurstöður: Niðurstöðurnar sýna að súrt pH og lífeðlisfræðilegt raflausninnihald veldur almennt míkróna-skala samloðun, sem hægt er að miðla með myndun lífsameinda kórónu.Það er athyglisvert að stærri agnir sýna meiri viðnám gegn utanaðkomandi áhrifum en smærri hliðstæða þeirra.In vitro frumudrepandi eiturverkanir og bakteríudrepandi próf voru gerðar með því að meðhöndla frumur með nanóagnahópum á mismunandi samsöfnunarstigum.Ályktun: Niðurstöður okkar sýna djúpstæða fylgni milli kvoðastöðugleika og eiturhrifa AgNPs, þar sem mikil samsöfnun leiðir til algjörs taps á líffræðilegri virkni.Hærra stig andsamloðun sem sést hefur fyrir stærri agnir hefur veruleg áhrif á eiturverkanir í glasi, vegna þess að slík sýni halda meiri sýkla- og spendýrafrumuvirkni.Þessar niðurstöður leiða til þeirrar ályktunar að þrátt fyrir almennt álit í viðkomandi bókmenntum, gæti það ekki verið besta leiðin til að miða á minnstu mögulegu nanóagnir.Lykilorð: fræmiðillinn vöxtur, kvoðastöðugleiki, stærðarháð söfnunarhegðun, eituráhrif á söfnunarskaða
Eftir því sem eftirspurn og framleiðsla nanóefna heldur áfram að aukast er meiri og meiri athygli beint að líföryggi þeirra eða líffræðilegri virkni.Silfur nanóagnir (AgNP) eru einn af algengustu mynduðu, rannsökuðu og notuðu fulltrúar þessa flokks efna vegna framúrskarandi hvarfa-, sjón- og líffræðilegra eiginleika þeirra.1 Almennt er talið að einstaka eiginleika nanóefna (þar á meðal AgNP) megi aðallega rekja til stórs tiltekins yfirborðs þeirra.Þess vegna er óumflýjanlega vandamálið hvaða ferli sem hefur áhrif á þennan lykileiginleika, svo sem kornastærð, yfirborðshúð eða samsöfnun, hvort það muni alvarlega skaða eiginleika nanóagna sem eru mikilvægar fyrir tilteknar notkunir.
Áhrif kornastærðar og sveiflujöfnunar eru efni sem hafa verið tiltölulega vel skjalfest í bókmenntum.Til dæmis er almennt viðurkennt sjónarmið að smærri nanóagnir séu eitraðari en stærri nanóagnir.2 Í samræmi við almennar heimildir hafa fyrri rannsóknir okkar sýnt fram á stærðarháða virkni nanósilfurs á spendýrafrumur og örverur.3– 5 Yfirborðshúð er annar eiginleiki sem hefur víðtæk áhrif á eiginleika nanóefna.Bara með því að bæta við eða breyta stöðugleikaefnum á yfirborði þess, getur sama nanóefnið haft gjörólíka eðlisfræðilega, efnafræðilega og líffræðilega eiginleika.Notkun lokunarefna er oftast framkvæmd sem hluti af myndun nanóagna.Til dæmis eru sítratlokaðar silfurnanóagnir ein mikilvægasta AgNP í rannsókninni, sem eru mynduð með því að minnka silfursölt í valinni stöðugleikalausn sem hvarfefni.6 Sítrat getur auðveldlega nýtt sér lágan kostnað, aðgengi, lífsamrýmanleika og sterka sækni í silfur, sem getur endurspeglast í ýmsum fyrirhuguðum milliverkunum, allt frá afturkræfri yfirborðsaðsog til jónasamskipta.Lítil sameindir og fjölatóma jónir nálægt 7,8, eins og sítröt, fjölliður, fjölraflausnir og líffræðilegir efnisþættir eru einnig almennt notaðar til að koma á stöðugleika í nanó-silfri og framkvæma einstaka virkni á því.9-12
Þrátt fyrir að möguleikinn á að breyta virkni nanóagna með viljandi yfirborðsþekju sé mjög áhugavert svæði, er meginhlutverk þessarar yfirborðshúðunar hverfandi, sem veitir kvoðastöðugleika fyrir nanóagnakerfið.Stórt tiltekið yfirborð nanóefna mun framleiða mikla yfirborðsorku, sem hindrar varmafræðilega getu kerfisins til að ná lágmarksorku sinni.13 Án viðeigandi stöðugleika getur þetta leitt til þéttingar nanóefna.Samsöfnun er myndun agna af ýmsum stærðum og gerðum sem á sér stað þegar dreifðar agnir mætast og núverandi varmafræðileg víxlverkun gerir agnunum kleift að loðast hver við aðra.Þess vegna eru sveiflujöfnun notuð til að koma í veg fyrir samsöfnun með því að setja nægilega stóran fráhrindandi kraft á milli agnanna til að vinna gegn varmafræðilegu aðdráttarafl þeirra.14
Þrátt fyrir að efni kornastærðar og yfirborðsþekju hafi verið kannað ítarlega í samhengi við stjórnun þess á líffræðilegri starfsemi af völdum nanóagna, er agnasamsöfnun að mestu vanrækt svæði.Það er nánast engin ítarleg rannsókn til að leysa kvoðastöðugleika nanóagna við líffræðilega viðeigandi aðstæður.10,15-17 Að auki er þetta framlag sérstaklega sjaldgæft, þar sem eiturverkanir sem tengjast samloðun hafa einnig verið rannsökuð, jafnvel þótt það geti valdið aukaverkunum, svo sem segamyndun í æðum, eða tapi á æskilegum eiginleikum, svo sem eiturverkunum, eins og sýnd á mynd 1.18, 19 sýnd.Reyndar er einn af fáum þekktum aðferðum viðnáms silfurnanóagna tengdur samloðun, vegna þess að greint er frá því að ákveðnir E. coli og Pseudomonas aeruginosa stofnar dragi úr nanó-silfri næmi með því að tjá flagellin próteinið, flagellin.Það hefur mikla sækni í silfur og veldur því samsöfnun.20
Það eru nokkrir mismunandi aðferðir sem tengjast eituráhrifum silfur nanóagna og samsöfnun hefur áhrif á alla þessa aðferðir.Mest umrædda aðferðin við AgNP líffræðilega virkni, stundum nefnd „Trojan Horse“ vélbúnaðurinn, lítur á AgNP sem Ag+ burðarefni.1,21 Trójuhestbúnaðurinn getur tryggt mikla aukningu á staðbundnum Ag+ styrk, sem leiðir til myndunar ROS og himnuafskautun.22-24 Samsöfnun getur haft áhrif á losun Ag+ og þar með haft áhrif á eiturhrif, vegna þess að það dregur úr virka virka yfirborðinu þar sem silfurjónir geta oxast og leyst upp.Hins vegar munu AgNP ekki aðeins sýna eiturhrif með losun jóna.Taka verður tillit til margra stærðar- og formfræðitengdra milliverkana.Meðal þeirra eru stærð og lögun yfirborðs nanóagna aðaleinkennin.4,25 Hægt er að flokka safn þessara aðferða sem „framkallaða eiturhrifakerfi“.Það eru hugsanlega mörg hvatbera- og yfirborðshimnuviðbrögð sem geta skemmt frumulíffæri og valdið frumudauða.25-27 Þar sem myndun fyllinga hefur náttúrulega áhrif á stærð og lögun hluta sem innihalda silfur sem þekkjast af lifandi kerfum, geta þessi samskipti einnig haft áhrif.
Í fyrri grein okkar um söfnun silfurnanóagna sýndum við árangursríka skimunaraðferð sem samanstendur af efnafræðilegum og in vitro líffræðilegum tilraunum til að rannsaka þetta vandamál.19 Dynamic Light Scattering (DLS) er ákjósanleg tækni fyrir þessar tegundir skoðana vegna þess að efnið getur dreift ljóseindum á bylgjulengd sem er sambærileg við stærð agna þess.Þar sem Brownískur hreyfihraði agna í vökvamiðlinum er tengdur stærðinni, er hægt að nota breytinguna á styrk dreifðs ljóss til að ákvarða meðaltal vatnaflfræðilegs þvermáls (Z-meðaltal) vökvasýnisins.28 Að auki, með því að setja spennu á sýnið, er hægt að mæla zeta-möguleika (ζ-möguleika) nanóeindarinnar á svipaðan hátt og Z meðalgildið.13,28 Ef algildi zeta-spennunnar er nógu hátt (samkvæmt almennum leiðbeiningum> ±30 mV), mun það mynda sterka rafstöðueiginleika fráhrindingu milli agnanna til að vinna gegn samsöfnuninni.Einkennandi yfirborðsplasmonresonance (SPR) er einstakt sjónrænt fyrirbæri, aðallega rakið til góðmálma nanóagna (aðallega Au og Ag).29 Byggt á rafrænum sveiflum (yfirborðsplasmónum) þessara efna á nanóskalanum er vitað að kúlulaga AgNP hafa einkennandi UV-Vis frásogstopp nálægt 400 nm.30 Styrkleiki og bylgjulengdarbreyting agnanna er notuð til að bæta við DLS niðurstöðurnar, þar sem þessa aðferð er hægt að nota til að greina samsöfnun nanóagna og yfirborðsaðsog lífsameinda.
Byggt á þeim upplýsingum sem fengnar eru eru frumulífvænleika (MTT) og bakteríudrepandi próf framkvæmdar á þann hátt að AgNP eiturhrifum er lýst sem fall af samloðun stigi, frekar en (algengasti þátturinn) styrkur nanóagna.Þessi einstaka aðferð gerir okkur kleift að sýna fram á hið mikla mikilvægi samloðunarstigs í líffræðilegri virkni, vegna þess að til dæmis sítrat-lokað AgNPs missa algjörlega líffræðilega virkni sína innan nokkurra klukkustunda vegna samsöfnunar.19
Í núverandi vinnu stefnum við að því að stórauka fyrri framlag okkar í stöðugleika lífatengdra kvoða og áhrif þeirra á líffræðilega virkni með því að rannsaka áhrif nanókornastærðar á samsöfnun nanóagna.Þetta er án efa ein af rannsóknum á nanóögnum.Meira áberandi sjónarhorn og 31 Til að kanna þetta mál var fræmiðlaðri vaxtaraðferð notuð til að framleiða sítrat-lokað AgNPs á þremur mismunandi stærðarsviðum (10, 20 og 50 nm).6,32 sem ein algengasta aðferðin.Fyrir nanóefni sem eru mikið og reglulega notuð í læknisfræðilegum tilgangi eru sítratlokuð AgNP af mismunandi stærðum valin til að rannsaka mögulega stærðarfíkn líffræðilegra eiginleika nanósilfurs sem tengist samansöfnun.Eftir að hafa búið til AgNP af mismunandi stærðum einkenndum við framleidd sýni með rafeindasmásjá (TEM) og skoðuðum síðan agnirnar með því að nota áðurnefnda skimunaraðferð.Að auki, í nærveru in vitro frumuræktanna Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) og Fetal Bovine Serum (FBS), var stærðarháð samloðun hegðun og hegðun hennar metin við mismunandi pH gildi, NaCl, glúkósa og glútamín styrk.Eiginleikar frumueiturhrifa eru ákvörðuð við alhliða aðstæður.Samstaða vísindanna gefur til kynna að almennt séu smærri agnir ákjósanlegri;Rannsókn okkar veitir efnafræðilegan og líffræðilegan vettvang til að ákvarða hvort þetta sé raunin.
Þrjár silfur nanóagnir með mismunandi stærðarsvið voru framleiddar með fræmiðluðu vaxtaraðferðinni sem Wan o.fl. lagði til, með smávægilegum breytingum.6 Þessi aðferð byggir á efnafræðilegri afoxun, með því að nota silfurnítrat (AgNO3) sem silfurgjafa, natríumbórhýdríð (NaBH4) sem afoxunarefni og natríumsítrat sem sveiflujöfnun.Fyrst skaltu búa til 75 ml af 9 mM sítrat vatnslausn úr natríumsítrat tvíhýdrati (Na3C6H5O7 x 2H2O) og hita í 70°C.Síðan var 2 mL af 1% w/v AgNO3 lausn bætt út í hvarfmiðilinn og síðan var nýútbúinni natríumbórhýdríðlausninni (2 mL 0,1% w/v) hellt í blönduna í dropatali.Gulbrúnu sviflausninni sem myndaðist var haldið við 70°C með kröftugri hræringu í 1 klukkustund og síðan kæld niður í stofuhita.Sýnið sem myndast (vísað til sem AgNP-I héðan í frá) er notað sem grunnur fyrir fræmiðlaðan vöxt í næsta myndunarþrepi.
Til að búa til meðalstóra agnasviflausn (táknað sem AgNP-II), hitið 90 mL 7,6 mM sítratlausn í 80°C, blandið henni saman við 10 mL AgNP-I og blandið síðan 2 mL 1% w/v AgNO3 lausninni. var haldið undir öflugri vélrænni hræringu í 1 klukkustund og síðan var sýnið kælt niður í stofuhita.
Fyrir stærstu ögnina (AgNP-III) skaltu endurtaka sama vaxtarferlið, en í þessu tilviki skaltu nota 10 ml af AgNP-II sem fræsviflausn.Eftir að sýnin ná stofuhita stilla þau nafnstyrk AgNO3 miðað við heildarmagn AgNO3 í 150 ppm með því að bæta við eða gufa upp viðbótarleysi við 40°C og að lokum geyma þau við 4°C þar til frekari notkun.
Notaðu FEI Tecnai G2 20 X-Twin Transmission Rafeindasmásjá (TEM) (FEI Corporate Headquarters, Hillsboro, Oregon, Bandaríkjunum) með 200 kV hröðunarspennu til að skoða formfræðilega eiginleika nanóagna og fanga rafeindabeygjumynstur (ED) þeirra.Að minnsta kosti 15 dæmigerðar myndir (~750 agnir) voru metnar með ImageJ hugbúnaðarpakkanum og súluritin sem fengust (og öll línurit í allri rannsókninni) voru búnar til í OriginPro 2018 (OriginLab, Northampton, MA, Bandaríkjunum) 33, 34.
Meðal vatnsaflsþvermál (Z-meðaltal), zeta-möguleiki (ζ-möguleiki) og einkennandi yfirborðsplasmonresonance (SPR) sýnanna voru mæld til að sýna upphaflega kvoðueiginleika þeirra.Meðal vatnsaflsþvermál og zeta-geta sýnisins voru mæld með Malvern Zetasizer Nano ZS tækinu (Malvern Instruments, Malvern, Bretlandi) með því að nota einnota samanbrotnar háræðafrumur við 37±0,1°C.Ocean Optics 355 DH-2000-BAL UV-Vis litrófsmælir (Halma PLC, Largo, FL, USA) var notaður til að fá einkennandi SPR eiginleika frá UV-Vis frásogsróf sýna á bilinu 250-800 nm.
Í allri tilrauninni voru framkvæmdar á sama tíma þrjár mismunandi mælingar tengdar kvoðastöðugleika.Notaðu DLS til að mæla meðaltal vatnaflfræðilegs þvermál (Z meðaltal) og zeta-getu (ζ-möguleika) agnanna, vegna þess að Z-meðaltalið tengist meðalstærð nanóagnasamstæðunnar, og zeta-getan gefur til kynna hvort rafstöðueiginleiki í kerfinu er nógu sterkt til að vega upp á móti Van der Waals aðdráttarafl milli nanóagna.Mælingar eru gerðar í þríriti og staðalfrávik Z meðaltals og zeta-getu er reiknað með Zetasizer hugbúnaði.Einkennandi SPR litróf agnanna eru metin með UV-Vis litrófsgreiningu, vegna þess að breytingar á hámarksstyrk og bylgjulengd geta bent til samsöfnunar og yfirborðsvíxlverkunar.29,35 Reyndar er yfirborðsplasmonómun í góðmálmum svo áhrifamikil að hún hefur leitt til nýrra aðferða við greiningu á lífsameindum.29,36,37 Styrkur AgNPs í tilraunablöndunni er um 10 ppm, og tilgangurinn er að stilla styrkleika hámarks upphafs SPR frásogs á 1. Tilraunin var framkvæmd á tímaháðan hátt á 0;1,5;3;6;12 og 24 klukkustundir við ýmsar líffræðilega viðeigandi aðstæður.Frekari upplýsingar um tilraunina má sjá í fyrri verkum okkar.19 Í stuttu máli, ýmis pH-gildi (3; 5; 7,2 og 9), mismunandi styrkur natríumklóríðs (10 mM; 50 mM; 150 mM), glúkósa (3,9 mM; 6,7 mM) og glútamíns (4 mM) og útbjó einnig Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) og Fetal Bovine Serum (FBS) (í vatni og DMEM) sem líkankerfi, og rannsakaði áhrif þeirra á söfnunarhegðun tilbúnu silfurnanóagnanna.pH gildi NaCl, glúkósa og glútamíns eru metin út frá lífeðlisfræðilegum styrk, en magn DMEM og FBS er það sama og gildin sem notuð eru í allri in vitro tilrauninni.38-42 Allar mælingar voru gerðar við pH 7,2 og 37°C með stöðugum bakgrunnssaltstyrk upp á 10 mM NaCl til að útrýma hvers kyns víxlverkun agna í langri fjarlægð (nema ákveðnar pH- og NaCl-tengdar tilraunir, þar sem þessir eiginleikar eru breyturnar skv. nám).28 Listi yfir ýmis skilyrði er tekin saman í töflu 1. Tilraunin merkt með † er notuð til viðmiðunar og samsvarar sýni sem inniheldur 10 mM NaCl og pH 7,2.
Krabbameinfrumulína í mönnum (DU145) og ódauðlegar keratínfrumur úr mönnum (HaCaT) voru fengnar frá ATCC (Manassas, VA, Bandaríkjunum).Frumur eru reglulega ræktaðar í Dulbecco's minimum essential medium Eagle (DMEM) sem inniheldur 4,5 g/L glúkósa (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, Bandaríkjunum), bætt við 10% FBS, 2 mM L-glútamín, 0,01% Streptomycin og 0,005% Pensilín (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Bandaríkjunum).Frumurnar eru ræktaðar í 37°C hitakassa undir 5% CO2 og 95% raka.
Til þess að kanna breytingar á AgNP frumueiturhrifum af völdum agnasamsöfnunar á tímaháðan hátt var gerð tveggja þrepa MTT próf.Fyrst var lífvænleiki frumugerðanna tveggja mældur eftir meðferð með AgNP-I, AgNP-II og AgNP-III.Í þessu skyni voru tvær tegundir frumna sáð í 96-brunn plötur með þéttleika 10.000 frumur/holu og meðhöndlaðar með þremur mismunandi stærðum af silfur nanóögnum í vaxandi styrk á öðrum degi.Eftir 24 klukkustunda meðferð voru frumurnar þvegnar með PBS og ræktaðar með 0,5 mg/mL MTT hvarfefni (SERVA, Heidelberg, Þýskalandi) þynnt í ræktunarmiðli í 1 klukkustund við 37°C.Formazan kristallar voru leystir upp í DMSO (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, Bandaríkjunum), og frásogið var mælt við 570 nm með því að nota Synergy HTX plötulesara (BioTek-Hungary, Budapest, Ungverjaland).Frásogsgildi ómeðhöndlaðs viðmiðunarsýnis er talið vera 100% lifun.Framkvæma að minnsta kosti 3 tilraunir með því að nota fjórar sjálfstæðar líffræðilegar endurtekningar.IC50 er reiknað út frá skammtasvörunarferil sem byggir á niðurstöðum lífskrafts.
Síðan, í öðru skrefi, með því að rækta agnirnar með 150 mM NaCl í mismunandi tíma (0, 1,5, 3, 6, 12 og 24 klukkustundir) fyrir frumumeðferð, voru mismunandi samloðun silfurnanóagna framleidd.Í kjölfarið var sama MTT prófið framkvæmt og áður hefur verið lýst til að meta breytingar á lífvænleika frumna sem verða fyrir áhrifum af agnasamsöfnun.Notaðu GraphPad Prism 7 til að meta lokaniðurstöðuna, reiknaðu tölfræðilega marktekt tilraunarinnar með óparuðu t-prófi og merktu stig hennar sem * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01), *** (p ≤ 0,001) ) Og **** (p ≤ 0,0001).
Þrjár mismunandi stærðir silfurnanóagna (AgNP-I, AgNP-II og AgNP-III) voru notaðar fyrir sýklalyfjanæmi fyrir Cryptococcus neoformans IFM 5844 (IFM; Research Center for Pathogenic Fungi and Microbial Toxicology, Chiba University) og Bacillus Test megaterium SZMC 6031 (SZMC: Szeged Microbiology Collection) og E. coli SZMC 0582 í RPMI 1640 miðli (Sigma-Aldrich Co.).Til þess að meta breytingar á bakteríudrepandi virkni af völdum samsöfnunar agna, var í fyrsta lagi ákvarðaður lágmarkshemjandi styrkur þeirra (MIC) með örþynningu í 96-brunnu örtítraplötu.Í 50 μL af stöðluðu frumusviflausn (5 × 104 frumur/ml í RPMI 1640 miðli), bætið 50 μL af silfur nanóagna sviflausn og raðþynnt tvöfaldan styrk (í áðurnefndum miðli er bilið 0 og 75 ppm, þ.e. viðmiðunarsýnið inniheldur 50 μL af frumusviflausn og 50 μL af miðli án nanóagna).Síðan var platan ræktuð við 30°C í 48 klukkustundir og ljósþéttleiki ræktunar mældur við 620 nm með SPECTROstar Nano plötulesara (BMG LabTech, Offenburg, Þýskalandi).Tilraunin var gerð þrisvar sinnum í þríriti.
Fyrir utan að 50 μL af stökum samanlögðum nanóagnasýnum voru notuð á þessum tíma, var sama aðferð og áður hefur verið lýst notuð til að kanna áhrif samloðunarinnar á bakteríudrepandi virkni á fyrrnefnda stofna.Mismunandi samsöfnunarástand silfurnanóagna er framleitt með því að rækta agnirnar með 150 mM NaCl í mismunandi tíma (0, 1,5, 3, 6, 12 og 24 klukkustundir) fyrir frumuvinnslu.Sviflausn sem bætt var við 50 μL af RPMI 1640 miðli var notuð sem vaxtarstjórnun, en til að stjórna eiturhrifum var notuð sviflausn með ósamsettum nanóögnum.Tilraunin var gerð þrisvar sinnum í þríriti.Notaðu GraphPad Prism 7 til að meta lokaniðurstöðuna aftur með því að nota sömu tölfræðigreiningu og MTT greiningin.
Söfnunarstig minnstu agnanna (AgNP-I) hefur verið einkennt og niðurstöðurnar voru birtar að hluta í fyrri vinnu okkar, en til betri samanburðar voru allar agnir skimaðar vandlega.Tilraunagögnunum er safnað og fjallað um þær í eftirfarandi köflum.Þrjár stærðir af AgNP.19
Mælingar framkvæmdar af TEM, UV-Vis og DLS sannreyndu árangursríka myndun allra AgNP sýna (Mynd 2A-D).Samkvæmt fyrstu röðinni á mynd 2 sýnir minnsta ögnin (AgNP-I) samræmda kúlulaga formgerð með meðalþvermál um 10 nm.Fræmiðlaða vaxtaraðferðin veitir einnig AgNP-II og AgNP-III mismunandi stærðarsvið með meðalagnaþvermál um það bil 20 nm og 50 nm, í sömu röð.Samkvæmt staðalfráviki agnadreifingar skarast stærðir sýnanna þriggja ekki, sem er mikilvægt fyrir samanburðargreiningu þeirra.Með því að bera saman meðaltalshlutfall og þynnkuhlutfall TEM-undirstaða 2D ögnavörpun, er gert ráð fyrir að kúlustig agnanna sé metið með lögunarsíuviðbót ImageJ (Mynd 2E).43 Samkvæmt greiningu á lögun agna er stærðarhlutfall þeirra (stór hlið/stutt hlið á minnsta afmarkandi rétthyrningnum) ekki fyrir áhrifum af agnavexti og þynningarhlutfall þeirra (mælt flatarmál samsvarandi fullkomins hrings/fræðilegs svæðis) ) minnkar smám saman.Þetta hefur í för með sér fleiri og fleiri polyhedral agnir, sem eru fullkomlega kringlóttar í orði, sem samsvarar þynnkuhlutfallinu 1.
Mynd 2 Sendingarrafeindasmásjá (TEM) mynd (A), rafeindadreifingarmynstur (ED) (B), stærðardreifingarsúlurit (C), einkennandi útfjólubláu sýnilegt (UV-Vis) ljósgleypnisvið (D) og meðalvökva sítrat -Endar silfur nanóagnir með vélrænni þvermál (Z-meðaltal), zeta-getu, stærðarhlutfalli og þykktarhlutfalli (E) hafa þrjú mismunandi stærðarsvið: AgNP-I er 10 nm (efri röð), AgNP -II er 20 nm (miðröð ), AgNP-III (neðri röð) er 50 nm.
Þrátt fyrir að hringlaga eðli vaxtaraðferðarinnar hafi haft áhrif á lögun agna að einhverju leyti, sem leiddi til minni kúlulaga stærri AgNPs, héldust öll þrjú sýnin hálfkúlulaga.Að auki, eins og sýnt er á rafeindadiffrunarmynstri á mynd 2B, nanó. Kristöllun agna hefur ekki áhrif.Áberandi sveifluhringurinn - sem hægt er að tengja við (111), (220), (200) og (311) Miller vísitölur silfurs - er mjög í samræmi við vísindarit og fyrri framlög okkar.9, 19,44 Brotnun Debye-Scherrer hringsins AgNP-II og AgNP-III stafar af því að ED myndin er tekin með sömu stækkun, þannig að eftir því sem kornastærð eykst, þá er fjöldi dreifðra agna pr. flatarmálseining eykst og minnkar.
Vitað er að stærð og lögun nanóagna hefur áhrif á líffræðilega virkni.3,45 Formháð hvata- og líffræðilega virkni má útskýra með því að mismunandi form hafa tilhneigingu til að fjölga ákveðnum kristalsflötum (með mismunandi Miller-vísitölu) og þessi kristalflöt hafa mismunandi virkni.45,46 Þar sem tilbúnar agnirnar gefa svipaðar ED niðurstöður sem samsvara mjög svipuðum kristaleiginleikum, má gera ráð fyrir að í síðari tilraunum okkar á kvoðastöðugleika og líffræðilegri virkni, ætti allur sá munur að rekja til stærð nanókorna, ekki lögunartengdra eiginleika.
UV-Vis niðurstöðurnar sem teknar eru saman á mynd 2D leggja enn frekar áherslu á yfirgnæfandi kúlulaga eðli tilbúna AgNP, vegna þess að SPR toppar allra þriggja sýnanna eru um 400 nm, sem er einkennandi gildi kúlulaga silfurnanóagna.29,30 Fanga litrófið staðfesti einnig árangursríkan fræmiðlaðan vöxt nanósilfurs.Eftir því sem kornastærð eykst mun bylgjulengdin sem samsvarar hámarks ljósgleypni AgNP-II-meira áberandi-Samkvæmt fræðiritum, AgNP-III Upplifði rauðvik.6,29
Varðandi upphaflegan kvoðustöðugleika AgNP kerfisins var DLS notað til að mæla meðaltal vatnsaflsþvermáls og zeta-getu agna við pH 7,2.Niðurstöðurnar sem sýndar eru á mynd 2E sýna að AgNP-III hefur meiri kvoðastöðugleika en AgNP-I eða AgNP-II, vegna þess að algengar leiðbeiningar gefa til kynna að zeta möguleiki upp á 30 mV algert sé nauðsynlegur fyrir langtíma kvoðastöðugleika. Þessi niðurstaða er enn studd þegar Z-meðalgildið (fengið sem meðaltal vatnsaflsþvermál frjálsra og samansafnaðra agna) er borið saman við aðalagnastærð sem fæst með TEM, vegna þess að því nær sem gildin tvö eru, því mildari er söfnunarstigið í sýninu.Reyndar er Z-meðaltal AgNP-I og AgNP-II hæfilega hærra en aðal-TEM-metin kornastærð þeirra, þannig að miðað við AgNP-III er spáð að þessi sýni séu líklegri til að safnast saman, þar sem mjög neikvæðir zeta-möguleikar fylgir nærri stærð Z meðaltalsgildi.
Skýringin á þessu fyrirbæri getur verið tvíþætt.Annars vegar er sítratstyrknum haldið á svipuðu stigi í öllum myndunarþrepum, sem gefur tiltölulega mikið magn af hlaðnum yfirborðshópum til að koma í veg fyrir að tiltekið yfirborð vaxandi agna minnki.Hins vegar, samkvæmt Levak o.fl., er auðvelt að skipta um litlar sameindir eins og sítrat með lífsameindum á yfirborði nanóagnanna.Í þessu tilviki mun kvoðastöðugleiki ákvarðast af kórónu lífsameindanna sem framleiddar eru.31 Vegna þess að þessi hegðun kom einnig fram í samanlagsmælingum okkar (rædd nánar síðar), getur sítratþak ein og sér ekki útskýrt þetta fyrirbæri.
Aftur á móti er kornastærðin í öfugu hlutfalli við samsöfnunartilhneigingu á nanómetrastigi.Þetta er aðallega stutt af hefðbundinni Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO) aðferð, þar sem aðdráttarafl agna er lýst sem summa aðdráttar- og fráhrindandi krafta milli agna.Samkvæmt He o.fl. minnkar hámarksgildi DLVO orkuferilsins með stærð nanóagnanna í hematít nanóögnunum, sem gerir það auðveldara að ná lágmarks frumorku og stuðlar þannig að óafturkræfri samloðun (þéttingu).47 Hins vegar er getgátur um að það séu aðrir þættir umfram takmarkanir DLVO kenningarinnar.Þrátt fyrir að van der Waals þyngdarafl og rafstöðueiginleg tvöföld fráhrindun séu svipuð með vaxandi kornastærð, endurskoðun Hotze o.fl.leggur til að það hafi sterkari áhrif á samsöfnun en DLVO leyfir.14 Þeir telja að ekki sé lengur hægt að áætla yfirborðsbeygju nanóagna sem flatt yfirborð, sem gerir stærðfræðimat ónothæft.Þar að auki, þegar kornastærðin minnkar, verður hlutfall atóma sem eru til staðar á yfirborðinu hærra, sem leiðir til rafrænnar uppbyggingu og yfirborðshleðsluhegðun.Og yfirborðs hvarfvirkni breytist, sem getur leitt til lækkunar á hleðslu í rafmagns tvöfalda laginu og stuðlað að samloðun.
Þegar DLS niðurstöður AgNP-I, AgNP-II og AgNP-III voru bornar saman á mynd 3, sáum við að öll þrjú sýnin sýndu svipað pH sem hvetur til samsöfnunar.Mjög súrt umhverfi (pH 3) færir zeta-getu sýnisins yfir í 0 mV, sem veldur því að agnir mynda míkron-stærðar agnir, en basískt pH-breytir zeta-getu þess í hærra neikvætt gildi, þar sem agnirnar mynda minni agnir (pH 5 ).Og 7,2) ), eða vera alveg ósamsett (pH 9).Einnig kom fram nokkur mikilvægur munur á mismunandi sýnum.Alla tilraunina reyndist AgNP-I vera næmast fyrir pH-framkölluðum zeta-getubreytingum, vegna þess að zeta-geta þessara agna hefur minnkað við pH 7,2 miðað við pH 9, en AgNP-II og AgNP-III sýndu aðeins A töluverð breyting á ζ er í kringum pH 3. Að auki sýndi AgNP-II hægari breytingar og miðlungs zeta möguleika, en AgNP-III sýndi mildustu hegðun þessara þriggja, vegna þess að kerfið sýndi hæsta algera zeta gildið og hæga stefna hreyfingu, sem gefur til kynna AgNP-III Þola mest sýrustig af völdum samloðun.Þessar niðurstöður eru í samræmi við meðaltalsniðurstöður vatnafræðilegrar þvermálsmælinga.Miðað við kornastærð primers þeirra sýndi AgNP-I stöðuga hægfara samloðun við öll pH gildi, líklega vegna 10 mM NaCl bakgrunns, en AgNP-II og AgNP-III sýndu aðeins marktækt við pH 3 Of söfnun.Athyglisverðasti munurinn er sá að þrátt fyrir stóra nanóagnastærð myndar AgNP-III minnstu efnasamböndin við pH 3 á 24 klukkustundum, sem undirstrikar and-samloðun eiginleika þess.Með því að deila meðal Z AgNPs við pH 3 eftir 24 klukkustundir með gildi tilbúna sýnisins, má sjá að hlutfallslegar samanlagðar stærðir AgNP-I og AgNP-II hafa aukist um 50 sinnum, 42 sinnum og 22 sinnum , í sömu röð.III.
Mynd 3 Niðurstöður kraftmikillar ljósdreifingar úr sýninu af sítratlokuðum silfurnanóagna með vaxandi stærð (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II og 50 nm: AgNP-III) eru gefnar upp sem meðaltal vatnsaflsþvermáls (Z meðaltal) ) (hægri) Við mismunandi pH aðstæður breytist zeta möguleiki (vinstri) innan 24 klst.
Sú pH-háða samsöfnun sem sást hafði einnig áhrif á einkennandi yfirborðsplasmonresonance (SPR) AgNP sýnanna, eins og sést af UV-Vis litrófinu.Samkvæmt viðbótarmynd S1 er samsöfnun allra þriggja silfurnanóagna sviflausna fylgt eftir með lækkun á styrk SPR toppa þeirra og í meðallagi rauðri breytingu.Umfang þessara breytinga sem fall af sýrustigi er í samræmi við samsöfnunarstigið sem DLS niðurstöður spáð fyrir um, þó hafa nokkrar áhugaverðar tilhneigingar sést.Andstætt innsæinu kemur í ljós að meðalstórt AgNP-II er næmast fyrir SPR breytingum en hin tvö sýnin eru minna næm.Í SPR rannsóknum eru 50 nm fræðileg kornastærðarmörk, sem eru notuð til að greina agnir út frá rafeiginleikum þeirra.Lýsa má ögnum minni en 50 nm (AgNP-I og AgNP-II) sem einföldum dielektrískum tvípólum, en agnir sem ná eða fara yfir þessi mörk (AgNP-III) hafa flóknari rafeiginleika og ómun þeirra. .Þegar um er að ræða tvö smærri agnasýni má líta á AgNP sem einfalda tvípóla og plasma getur auðveldlega skarast.Þegar kornastærðin eykst framleiðir þessi tenging í rauninni stærra plasma, sem getur útskýrt hærra næmi sem sést.29 Hins vegar, fyrir stærstu agnirnar, er einfalda tvípólsmatið ekki gilt þegar önnur tengingarástand geta einnig átt sér stað, sem getur útskýrt minnkandi tilhneigingu AgNP-III til að gefa til kynna litrófsbreytingar.29
Við tilraunaaðstæður okkar er sannað að pH gildið hefur mikil áhrif á kvoðastöðugleika sítrathúðaðra silfurnanóagna af ýmsum stærðum.Í þessum kerfum er stöðugleiki veittur af neikvætt hlaðnum -COO- hópum á yfirborði AgNPs.Karboxýlatvirknihópur sítratjónarinnar er prótónaður í miklum fjölda H+ jóna, þannig að karboxýlhópurinn sem myndast getur ekki lengur veitt rafstöðueiginleika fráhrindingu milli agnanna, eins og sýnt er í efstu röð á mynd 4. Samkvæmt meginreglu Le Chatelier, AgNP sýni safnast fljótt saman við pH 3, en verða smám saman stöðugra eftir því sem pH hækkar.
Mynd 4 Skýringarmynd af yfirborðsverkun sem er skilgreind með samloðun við mismunandi pH (efstu röð), NaCl styrk (miðröð) og lífsameindir (neðri röð).
Samkvæmt mynd 5 var kvoðastöðugleiki í AgNP sviflausnum af mismunandi stærðum einnig skoðaður við aukinn saltstyrk.Byggt á zeta-möguleikanum veitir aukin nanóagnastærð í þessum sítratlokuðu AgNP kerfum aftur aukið viðnám gegn utanaðkomandi áhrifum frá NaCl.Í AgNP-I nægir 10 mM NaCl til að framkalla væga samloðun og saltstyrkur 50 mM gefur mjög svipaðar niðurstöður.Í AgNP-II og AgNP-III hefur 10 mM NaCl ekki marktæk áhrif á zeta-getu vegna þess að gildi þeirra haldast við (AgNP-II) eða undir (AgNP-III) -30 mV.Að auka NaCl styrkinn í 50 mM og að lokum í 150 mM NaCl er nóg til að draga verulega úr algildi zeta-getu í öllum sýnum, þó stærri agnir haldi neikvæðari hleðslu.Þessar niðurstöður eru í samræmi við væntanlegt meðaltal vatnsaflsþvermál AgNPs;Z meðalleitarlínur mældar á 10, 50 og 150 mM NaCl sýna mismunandi, smám saman vaxandi gildi.Að lokum greindust agnir af míkronstærð í öllum þremur 150 mM tilraununum.
Mynd 5 Niðurstöður kraftmikillar ljósdreifingar úr sýninu sítratlokuðu silfurnanóagna með vaxandi stærð (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II og 50 nm: AgNP-III) eru gefnar upp sem meðaltal vatnsaflsþvermáls (Z meðaltal) ) (hægri) og zeta möguleiki (vinstri) breytast innan 24 klukkustunda við mismunandi NaCl styrk.
UV-Vis niðurstöðurnar á viðbótarmynd S2 sýna að SPR af 50 og 150 mM NaCl í öllum þremur sýnunum hefur tafarlausa og marktæka lækkun.Þetta má útskýra með DLS, vegna þess að NaCl-undirstaða samsöfnun á sér stað hraðar en pH-háðar tilraunir, sem skýrist af miklum mun á fyrstu (0, 1,5 og 3 klst.) mælingum.Að auki mun aukning saltstyrks einnig auka hlutfallslega leyfilegan hæfileika tilraunamiðilsins, sem mun hafa mikil áhrif á yfirborðsplasmonómun.29
Áhrif NaCl eru tekin saman í miðröð myndar 4. Almennt má draga þá ályktun að aukning á styrk natríumklóríðs hafi svipuð áhrif og hækkun á sýrustigi, því Na+ jónir hafa tilhneigingu til að samræmast í kringum karboxýlathópana, bæla neikvæða zeta hugsanlega AgNPs.Að auki framleiddi 150 mM NaCl míkrónstærð safnefni í öllum þremur sýnunum, sem gefur til kynna að lífeðlisfræðilegur saltastyrkur sé skaðlegur kvoðastöðugleika sítratlokaðra AgNPs.Með því að íhuga mikilvægan þéttingarstyrk (CCC) NaCl á svipuðum AgNP kerfum er hægt að setja þessar niðurstöður á snjallan hátt í viðeigandi bókmenntum.Huynh o.fl.reiknað út að CCC af NaCl fyrir sítrat-enda silfur nanóagnir með meðalþvermál 71 nm væri 47,6 mM, en El Badawy o.fl.sá að CCC 10 nm AgNPs með sítrathúð var 70 mM.10,16 Að auki var marktækt hár CCC um 300 mM mældur af He et al., sem olli því að nýmyndunaraðferð þeirra var frábrugðin áðurnefndri útgáfu.48 Þrátt fyrir að núverandi framlag miði ekki að alhliða greiningu á þessum gildum, vegna þess að tilraunaaðstæður okkar eru að aukast í flókinni rannsókninni í heild, virðist líffræðilega viðeigandi NaCl styrkur 50 mM, sérstaklega 150 mM NaCl, vera nokkuð hár.Framkölluð storknun, sem útskýrir sterkar breytingar sem greindust.
Næsta skref í fjölliðunartilrauninni er að nota einfaldar en líffræðilega viðeigandi sameindir til að líkja eftir víxlverkun nanóagna og lífsameinda.Byggt á niðurstöðum DLS (myndir 6 og 7) og UV-Vis (viðbótarmyndir S3 og S4) er hægt að fullyrða nokkrar almennar ályktanir.Við tilraunaaðstæður okkar munu hinar rannsakaðar sameindir glúkósa og glútamín ekki framkalla samsöfnun í neinu AgNP kerfi, vegna þess að Z-meðalstefnan er nátengd samsvarandi viðmiðunarmælingargildi.Þrátt fyrir að tilvist þeirra hafi ekki áhrif á samloðun, sýna tilraunaniðurstöður að þessar sameindir aðsogast að hluta til á yfirborði AgNPs.Mest áberandi niðurstaðan sem styður þessa skoðun er sú breyting sem sést á ljósgleypni.Þrátt fyrir að AgNP-I sýni ekki marktækar breytingar á bylgjulengd eða styrkleika, er hægt að sjá það betur með því að mæla stærri agnir, sem er líklegast vegna meiri sjónnæmis sem áður var nefnt.Óháð styrkleika getur glúkósa valdið meiri rauðbreytingu eftir 1,5 klst. samanborið við samanburðarmælinguna, sem er um 40 nm í AgNP-II og um 10 nm í AgNP-III, sem sannar að yfirborðsvíxlverkun sé til staðar.Glútamín sýndi svipaða þróun, en breytingin var ekki svo augljós.Að auki er einnig vert að minnast á að glútamín getur dregið úr algerum zeta-getu meðalstórra og stórra agna.Hins vegar, þar sem þessar zeta-breytingar virðast ekki hafa áhrif á samsöfnunarstigið, má geta þess að jafnvel litlar lífsameindir eins og glútamín geti veitt ákveðna staðbundna fráhrindingu milli agna.
Mynd 6 Niðurstöður fyrir kraftmikla ljósdreifingu sítratlokaðra silfurnanóagnasýna með vaxandi stærð (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II og 50 nm: AgNP-III) eru gefnar upp sem meðalvatnsaflsþvermál (Z meðaltal) (hægri) Við ytri aðstæður með mismunandi styrk glúkósa breytist zeta-geta (vinstri) innan 24 klst.
Mynd 7 Niðurstöður kraftmikillar ljósdreifingar úr sítrat-enda silfurnanóagnasýninu með vaxandi stærð (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II og 50 nm: AgNP-III) eru gefnar upp sem meðaltal vatnsaflsþvermáls (Z meðaltal) ) (hægri) Í nærveru glútamíns breytist zeta möguleikinn (vinstri) innan 24 klukkustunda.
Í stuttu máli hafa litlar lífsameindir eins og glúkósa og glútamín ekki áhrif á kvoðastöðugleika við mældan styrk: þó að þær hafi mismikið áhrif á zeta-getu og UV-Vis niðurstöður, eru Z meðalniðurstöðurnar ekki í samræmi.Þetta gefur til kynna að yfirborðsásog sameinda hamli rafstöðueiginleika fráhrindingu, en veitir um leið víddarstöðugleika.
Til þess að tengja fyrri niðurstöður við fyrri niðurstöður og líkja betur eftir líffræðilegum aðstæðum völdum við nokkra af algengustu frumuræktunarhlutunum og notuðum þá sem tilraunaskilyrði til að rannsaka stöðugleika AgNP kvoða.Í allri in vitro tilrauninni er eitt mikilvægasta hlutverk DMEM sem miðils að koma á nauðsynlegum osmósuskilyrðum, en frá efnafræðilegu sjónarmiði er það flókin saltlausn með heildarjónastyrk svipað og 150 mM NaCl .40 Hvað FBS varðar, þá er það flókin blanda af lífsameindum - aðallega próteinum - frá sjónarhóli yfirborðsaðsogs, það á nokkur líkindi við tilraunaniðurstöður glúkósa og glútamíns, þrátt fyrir efnasamsetningu og fjölbreytileika Kynlífið er miklu flóknara.19 DLS og UV-Sýjulegu niðurstöðurnar sem sýndar eru á mynd 8 og viðbótarmynd S5, í sömu röð, má útskýra með því að skoða efnasamsetningu þessara efna og tengja þær við mælingarnar í fyrri hlutanum.
Mynd 8 Niðurstöður kraftmikillar ljósdreifingar úr sítrat-entuðu silfurnanóagnasýninu með vaxandi stærð (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II og 50 nm: AgNP-III) eru gefnar upp sem meðaltal vatnsaflsþvermáls (Z meðaltal) ) (hægri) Í viðurvist frumuræktunarþáttanna DMEM og FBS breytist zeta möguleiki (vinstri) innan 24 klst.
Þynning AgNPs af mismunandi stærðum í DMEM hefur svipuð áhrif á kvoðastöðugleika og sést í viðurvist hás NaCl styrks.Dreifing AgNP í 50 v/v% DMEM sýndi að samsöfnun í stórum stíl greindist með aukningu á zeta-getu og Z-meðalgildi og mikilli lækkun á SPR styrkleika.Rétt er að taka fram að hámarks heildarstærð sem DMEM framkallar eftir 24 klukkustundir er í öfugu hlutfalli við stærð frumnanóagna.
Samspil FBS og AgNP er svipað því sem sést í nærveru smærri sameinda eins og glúkósa og glútamíns, en áhrifin eru sterkari.Z meðaltal agnanna helst óbreytt á meðan aukning á zeta-getu greinist.SPR toppurinn sýndi lítilsháttar rauða breytingu, en kannski meira áhugavert að SPR styrkleiki minnkaði ekki eins marktækt og í samanburðarmælingunni.Þessar niðurstöður má skýra með meðfæddri aðsog stórsameinda á yfirborði nanóagna (neðri röð á mynd 4), sem nú er skilið sem myndun lífsameinda kórónu í líkamanum.49