В момента Javascript е деактивиран във вашия браузър.Когато javascript е деактивиран, някои функции на този уебсайт няма да работят.
Регистрирайте вашите специфични данни и специфични лекарства, които представляват интерес, и ние ще съпоставим предоставената от вас информация със статиите в нашата обширна база данни и ще ви изпратим PDF копие по имейл своевременно.
По-малките наночастици винаги ли са по-добри?Разберете биологичните ефекти на зависимата от размера агрегация на сребърни наночастици при биологично значими условия
Автори: Bélteky P, Rónavári A, Zakupszky D, Boka E, Igaz N, Szerencsés B, Pfeiffer I, Vágvölgyi C, Kiricsi M, Kónya Z
Péter Bélteky,1,* Andrea Rónavári,1,* Dalma Zakupszky,1 Eszter Boka,1 Nóra Igaz,2 Bettina Szerencsés,3 Ilona Pfeiffer,3 Csaba Vágvölgyi,3 Mónika Kiricsi от Химия на околната среда, Унгария, Факултет по наука и информатика на Унгария , Университет в Сегед;2 Катедра по биохимия и молекулярна биология, Факултет по наука и информация, Университет в Сегед, Унгария;3 Катедра по микробиология, Факултет по наука и информация, Университет в Сегед, Унгария;4MTA-SZTE Reaction Kinetics and Surface Chemistry Research Group, Szeged, Hungary* Тези автори допринесоха еднакво за тази работа.Комуникация: Zoltán Kónya Department of Applied and Environment Chemistry, Faculty of Science and Informatics, University of Szeged, Rerrich Square 1, Szeged, H-6720, Hungary Телефон +36 62 544620 Имейл [Защита на имейл] Цел: Сребърните наночастици (AgNP) са един от най-често изучаваните наноматериали, особено поради техните биомедицински приложения.Въпреки това, поради агрегацията на наночастиците, тяхната отлична цитотоксичност и антибактериална активност често са компрометирани в биологична среда.В тази работа бяха изследвани поведението на агрегиране и свързаните с него биологични активности на три различни проби от сребърни наночастици с цитратен край със среден диаметър 10, 20 и 50 nm.Метод: Използвайте трансмисионен електронен микроскоп, за да синтезирате и охарактеризирате наночастиците, да оцените поведението им на агрегиране при различни стойности на рН, концентрации на NaCl, глюкоза и глутамин чрез динамично разсейване на светлината и ултравиолетова спектроскопия.В допълнение, компонентите на средата за клетъчна култура като Dulbecco подобряват поведението на агрегация в Eagle Medium и Fetal Calf Serum.Резултати: Резултатите показват, че киселинното рН и физиологичното електролитно съдържание обикновено предизвикват агрегация в микронен мащаб, която може да бъде медиирана от образуването на биомолекулна корона.Струва си да се отбележи, че по-големите частици проявяват по-висока устойчивост на външни влияния от по-малките си двойници.In vitro цитотоксичност и антибактериални тестове бяха проведени чрез третиране на клетки с агрегати от наночастици на различни етапи на агрегиране.Заключение: Нашите резултати разкриват дълбока връзка между колоидната стабилност и токсичността на AgNP, тъй като екстремната агрегация води до пълна загуба на биологична активност.По-високата степен на антиагрегация, наблюдавана за по-големите частици, оказва значително влияние върху in vitro токсичността, тъй като такива проби запазват повече антимикробна и клетъчна активност на бозайници.Тези констатации водят до заключението, че въпреки общото мнение в съответната литература, насочването към най-малките възможни наночастици може да не е най-добрият курс на действие.Ключови думи: медииран от семена растеж, колоидна стабилност, зависимо от размера агрегатно поведение, токсичност при увреждане на агрегацията
Тъй като търсенето и производството на наноматериали продължават да се увеличават, все повече внимание се обръща на тяхната биобезопасност или биологична активност.Сребърните наночастици (AgNP) са едни от най-често синтезираните, изследвани и използвани представители на този клас материали поради техните отлични каталитични, оптични и биологични свойства.1 Обикновено се смята, че уникалните характеристики на наноматериалите (включително AgNP) се дължат главно на тяхната голяма специфична повърхност.Следователно неизбежният проблем е всеки процес, който засяга тази ключова характеристика, като размер на частиците, повърхностно покритие или агрегация, дали ще увреди сериозно свойствата на наночастиците, които са критични за конкретни приложения.
Ефектите от размера на частиците и стабилизаторите са теми, които са относително добре документирани в литературата.Например, общоприетото мнение е, че по-малките наночастици са по-токсични от по-големите наночастици.2 В съответствие с общата литература, нашите предишни проучвания демонстрираха зависимата от размера активност на наносреброто върху клетки и микроорганизми на бозайници.3–5 Повърхностното покритие е друг атрибут, който има широко влияние върху свойствата на наноматериалите.Само чрез добавяне или модифициране на стабилизатори на неговата повърхност, един и същ наноматериал може да има напълно различни физични, химични и биологични свойства.Прилагането на затварящи агенти най-често се извършва като част от синтеза на наночастици.Например, цитратно-терминираните сребърни наночастици са едни от най-подходящите AgNP в изследването, които се синтезират чрез редуциране на сребърни соли в избран разтвор на стабилизатор като реакционна среда.6 Цитратът може лесно да се възползва от своята ниска цена, наличност, биосъвместимост и силен афинитет към среброто, което може да бъде отразено в различни предложени взаимодействия, от обратима повърхностна адсорбция до йонни взаимодействия.Малки молекули и многоатомни йони близо до 7,8, като цитрати, полимери, полиелектролити и биологични агенти също често се използват за стабилизиране на нано-сребро и извършване на уникални функционализации върху него.9-12
Въпреки че възможността за промяна на активността на наночастиците чрез умишлено покриване на повърхността е много интересна област, основната роля на това повърхностно покритие е незначителна, осигурявайки колоидна стабилност за системата от наночастици.Голямата специфична повърхност на наноматериалите ще произведе голяма повърхностна енергия, което възпрепятства термодинамичната способност на системата да достигне минималната си енергия.13 Без подходяща стабилизация това може да доведе до агломерация на наноматериали.Агрегацията е образуването на агрегати от частици с различни форми и размери, което възниква, когато диспергираните частици се срещнат и настоящите термодинамични взаимодействия позволяват на частиците да се придържат една към друга.Следователно стабилизаторите се използват за предотвратяване на агрегацията чрез въвеждане на достатъчно голяма отблъскваща сила между частиците, за да се противодейства на тяхното термодинамично привличане.14
Въпреки че темата за размера на частиците и покритието на повърхността е подробно проучена в контекста на регулирането на биологичните дейности, предизвикани от наночастиците, агрегирането на частици е до голяма степен пренебрегвана област.Почти няма задълбочено проучване за решаване на колоидната стабилност на наночастиците при биологично подходящи условия.10,15-17 В допълнение, този принос е особено рядък, когато токсичността, свързана с агрегацията, също е изследвана, дори ако може да причини нежелани реакции, като съдова тромбоза, или загуба на желани характеристики, като токсичността му, като показано на фигура 1.18, 19 показано.Всъщност, един от малкото известни механизми на резистентност към сребърни наночастици е свързан с агрегацията, тъй като се съобщава, че някои щамове E. coli и Pseudomonas aeruginosa намаляват тяхната чувствителност към нано сребро чрез експресиране на протеина флагелин, flagellin.Има висок афинитет към среброто, като по този начин предизвиква агрегация.20
Има няколко различни механизма, свързани с токсичността на сребърните наночастици, и агрегацията засяга всички тези механизми.Най-обсъжданият метод за биологична активност на AgNP, понякога наричан механизъм „Троянски кон“, разглежда AgNP като носители на Ag+.1,21 Механизмът на троянския кон може да осигури голямо увеличение на локалната концентрация на Ag+, което води до генериране на ROS и деполяризация на мембраната.22-24 Агрегацията може да повлияе на освобождаването на Ag+, като по този начин повлияе на токсичността, тъй като намалява ефективната активна повърхност, където сребърните йони могат да се окислят и разтворят.Въпреки това, AgNPs няма да проявяват токсичност само чрез освобождаване на йони.Трябва да се вземат предвид много взаимодействия, свързани с размера и морфологията.Сред тях размерът и формата на повърхността на наночастиците са определящите характеристики.4,25 Съвкупността от тези механизми може да бъде категоризирана като „механизми на индуцирана токсичност“.Има потенциално много митохондриални и повърхностни мембранни реакции, които могат да увредят органелите и да причинят клетъчна смърт.25-27 Тъй като образуването на агрегати естествено влияе върху размера и формата на съдържащите сребро обекти, разпознати от живите системи, тези взаимодействия също могат да бъдат засегнати.
В нашата предишна статия за агрегирането на сребърни наночастици, ние демонстрирахме ефективна процедура за скрининг, състояща се от химически и in vitro биологични експерименти за изследване на този проблем.19 Динамичното разсейване на светлината (DLS) е предпочитаната техника за тези видове инспекции, тъй като материалът може да разпръсне фотони при дължина на вълната, сравнима с размера на неговите частици.Тъй като скоростта на Брауново движение на частиците в течната среда е свързана с размера, промяната в интензитета на разсеяната светлина може да се използва за определяне на средния хидродинамичен диаметър (Z-среден) на течната проба.28 В допълнение, чрез прилагане на напрежение към пробата, дзета потенциалът (ζ потенциал) на наночастицата може да бъде измерен подобно на средната Z стойност.13,28 Ако абсолютната стойност на зета потенциала е достатъчно висока (според общите насоки> ±30 mV), тя ще генерира силно електростатично отблъскване между частиците, за да противодейства на агрегацията.Характерният повърхностен плазмонен резонанс (SPR) е уникален оптичен феномен, приписван главно на наночастиците от благородни метали (главно Au и Ag).29​​ Въз основа на електронните трептения (повърхностни плазмони) на тези материали в наномащаба е известно, че сферичните AgNPs имат характерен UV-Vis абсорбционен пик близо до 400 nm.30 Интензитетът и изместването на дължината на вълната на частиците се използват за допълване на резултатите от DLS, тъй като този метод може да се използва за откриване на агрегиране на наночастици и повърхностна адсорбция на биомолекули.
Въз основа на получената информация, клетъчната жизнеспособност (MTT) и антибактериалните анализи се извършват по начин, по който токсичността на AgNP се описва като функция на нивото на агрегация, а не (най-често използвания фактор) концентрация на наночастици.Този уникален метод ни позволява да демонстрираме дълбокото значение на нивото на агрегация в биологичната активност, тъй като, например, цитратно-терминираните AgNP напълно губят своята биологична активност в рамките на няколко часа поради агрегация.19
В настоящата работа ние се стремим значително да разширим нашите предишни приноси в стабилността на био-свързаните колоиди и тяхното въздействие върху биологичната активност чрез изучаване на ефекта от размера на наночастиците върху агрегацията на наночастиците.Това несъмнено е едно от изследванията на наночастиците.Гледна точка с по-висок профил и 31 За да се изследва този проблем, беше използван метод за растеж, медииран от семена, за да се произведат AgNPs с цитратен край в три различни диапазона на размер (10, 20 и 50 nm).6,32 като един от най-разпространените методи.За наноматериали, които се използват широко и рутинно в медицински приложения, се избират цитратно-терминирани AgNP с различни размери, за да се изследва възможната зависимост от размера на свързаните с агрегацията биологични свойства на наносреброто.След синтезиране на AgNP с различни размери, ние характеризирахме произведените проби чрез трансмисионна електронна микроскопия (TEM) и след това изследвахме частиците, използвайки гореспоменатата процедура за скрининг.В допълнение, в присъствието на in vitro клетъчни култури Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) и фетален говежди серум (FBS), зависимото от размера поведение на агрегиране и неговото поведение бяха оценени при различни стойности на рН, концентрации на NaCl, глюкоза и глутамин.Характеристиките на цитотоксичността се определят при изчерпателни условия.Научният консенсус показва, че като цяло по-малките частици са за предпочитане;нашето разследване предоставя химическа и биологична платформа за определяне дали това е така.
Три сребърни наночастици с различни размери бяха приготвени чрез метода на растеж, медииран от семена, предложен от Wan et al., с леки корекции.6 Този метод се основава на химическа редукция, като се използва сребърен нитрат (AgNO3) като източник на сребро, натриев борохидрид (NaBH4) като редуциращ агент и натриев цитрат като стабилизатор.Първо, пригответе 75 mL от 9 mM цитратен воден разтвор от натриев цитрат дихидрат (Na3C6H5O7 x 2H2O) и загрейте до 70°C.След това към реакционната среда се добавят 2 mL от 1% w/v разтвор на AgNO3 и след това прясно приготвеният разтвор на натриев борохидрид (2 mL 0.1% w/v) се излива в сместа на капки.Получената жълто-кафява суспензия се поддържа при 70°С с енергично разбъркване в продължение на 1 час и след това се охлажда до стайна температура.Получената проба (отсега нататък наричана AgNP-I) се използва като основа за медииран от семена растеж в следващата стъпка на синтез.
За да синтезирате суспензия от частици със среден размер (означена като AgNP-II), загрейте 90 mL 7,6 mM разтвор на цитрат до 80°C, смесете го с 10 mL AgNP-I и след това смесете 2 mL 1% w/v разтвор на AgNO3 се държи при енергично механично разбъркване в продължение на 1 час и след това пробата се охлажда до стайна температура.
За най-голямата частица (AgNP-III) повторете същия процес на растеж, но в този случай използвайте 10 mL AgNP-II като суспензия от семена.След като пробите достигнат стайна температура, те задават своята номинална концентрация на Ag въз основа на общото съдържание на AgNO3 на 150 ppm чрез добавяне или изпаряване на допълнителен разтворител при 40°C и накрая ги съхраняват при 4°C до следваща употреба.
Използвайте FEI Tecnai G2 20 X-Twin Transmission Electron Microscope (TEM) (FEI Corporate Headquarters, Hillsboro, Oregon, USA) с 200 kV ускоряващо напрежение, за да изследвате морфологичните характеристики на наночастиците и да заснемете техния модел на електронна дифракция (ED).Най-малко 15 представителни изображения (~750 частици) бяха оценени с помощта на софтуерния пакет ImageJ и получените хистограми (и всички графики в цялото изследване) бяха създадени в OriginPro 2018 (OriginLab, Northampton, MA, USA) 33, 34.
Средният хидродинамичен диаметър (Z-средно), зета потенциал (ζ-потенциал) и характерен повърхностен плазмонен резонанс (SPR) на пробите бяха измерени, за да се илюстрират техните първоначални колоидни свойства.Средният хидродинамичен диаметър и зета потенциалът на пробата бяха измерени с инструмента Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK), използвайки сгънати капилярни клетки за еднократна употреба при 37 ± 0.1 ° C.Ocean Optics 355 DH-2000-BAL UV-Vis спектрофотометър (Halma PLC, Largo, FL, USA) беше използван за получаване на характерни SPR характеристики от UV-Vis абсорбционните спектри на проби в диапазона от 250-800 nm.
По време на целия експеримент бяха проведени едновременно три различни вида измервания, свързани с колоидната стабилност.Използвайте DLS за измерване на средния хидродинамичен диаметър (Z средно) и дзета потенциала (ζ потенциал) на частиците, тъй като Z средната е свързана със средния размер на агрегатите на наночастиците, а дзета потенциалът показва дали електростатичното отблъскване в системата е достатъчно силен, за да компенсира привличането на Ван дер Ваалс между наночастиците.Измерванията се извършват в три екземпляра и стандартното отклонение на Z средното и зета потенциала се изчислява от софтуера Zetasizer.Характерните SPR спектри на частиците се оценяват чрез UV-Vis спектроскопия, тъй като промените в пиковия интензитет и дължината на вълната могат да показват агрегация и повърхностни взаимодействия.29,35 Всъщност повърхностният плазмонен резонанс в благородните метали е толкова влиятелен, че е довел до нови методи за анализ на биомолекулите.29,36,37 Концентрацията на AgNPs в експерименталната смес е около 10 ppm и целта е да се настрои интензитетът на максималната първоначална SPR абсорбция на 1. Експериментът беше проведен по зависим от времето начин при 0;1,5;3;6;12 и 24 часа при различни биологично подходящи условия.Повече подробности, описващи експеримента, могат да се видят в предишната ни работа.19 Накратко, различни стойности на pH (3; 5; 7,2 и 9), различни концентрации на натриев хлорид (10 mM; 50 mM; 150 mM), глюкоза (3,9 mM; 6,7 mM) и глутамин (4 mM) и също подготви Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) и фетален говежди серум (FBS) (във вода и DMEM) като моделни системи и проучи техните ефекти върху поведението на агрегиране на синтезираните сребърни наночастици.pH Стойностите на NaCl, глюкоза и глутамин се оценяват на базата на физиологични концентрации, докато количествата DMEM и FBS са същите като нивата, използвани в целия in vitro експеримент.38-42 Всички измервания бяха извършени при pH 7,2 и 37°C с постоянна фонова концентрация на сол от 10 mM NaCl, за да се елиминират всякакви взаимодействия на частици на дълги разстояния (с изключение на определени експерименти, свързани с pH и NaCl, където тези атрибути са променливите под проучване).28 Списъкът с различни условия е обобщен в таблица 1. Експериментът, маркиран с †, се използва като референтен и съответства на проба, съдържаща 10 mM NaCl и pH 7,2.
Човешка клетъчна линия от рак на простатата (DU145) и обезсмъртени човешки кератиноцити (HaCaT) бяха получени от ATCC (Manassas, VA, USA).Клетките се култивират рутинно в минималната есенциална среда на Dulbecco Eagle (DMEM), съдържаща 4,5 g/L глюкоза (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), допълнена с 10% FBS, 2 mM L-глутамин, 0,01% стрептомицин и 0,005% Пеницилин (Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, Мисури, САЩ).Клетките се култивират в 37°C инкубатор при 5% CO2 и 95% влажност.
За да се изследват промените в цитотоксичността на AgNP, причинени от агрегацията на частици по зависим от времето начин, беше извършен двуетапен МТТ анализ.Първо, жизнеспособността на двата типа клетки беше измерена след третиране с AgNP-I, AgNP-II и AgNP-III.За тази цел двата типа клетки бяха посяти в 96-ямкови плаки при плътност от 10 000 клетки/ямка и третирани с три различни размера сребърни наночастици в нарастващи концентрации на втория ден.След 24 часа третиране клетките се промиват с PBS и се инкубират с 0.5 mg/mL MTT реагент (SERVA, Хайделберг, Германия), разреден в културална среда за 1 час при 37°С.Кристалите на формазан се разтварят в DMSO (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) и абсорбцията се измерва при 570 nm с помощта на четец на плаки Synergy HTX (BioTek-Унгария, Будапеща, Унгария).Стойността на абсорбция на нетретираната контролна проба се счита за 100% степен на преживяемост.Извършете поне 3 експеримента, като използвате четири независими биологични повторения.IC50 се изчислява от крива доза-отговор въз основа на резултатите за жизненост.
След това, във втория етап, чрез инкубиране на частиците със 150 mM NaCl за различни периоди от време (0, 1.5, 3, 6, 12 и 24 часа) преди третирането на клетките, бяха получени различни агрегатни състояния на сребърни наночастици.Впоследствие се извършва същият МТТ анализ, както е описано по-горе, за да се оценят промените в клетъчната жизнеспособност, засегнати от агрегацията на частици.Използвайте GraphPad Prism 7, за да оцените крайния резултат, изчислете статистическата значимост на експеримента чрез несдвоен t-тест и маркирайте нивото му като * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01), *** (p ≤ 0,001) ) И **** (р ≤ 0,0001).
Три различни размера сребърни наночастици (AgNP-I, AgNP-II и AgNP-III) бяха използвани за антибактериална чувствителност към Cryptococcus neoformans IFM 5844 (IFM; Изследователски център за патогенни гъби и микробна токсикология, Chiba University) и Bacillus Test megaterium SZMC 6031 (SZMC: Szeged Microbiology Collection) и Е. coli SZMC 0582 в среда RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Co.).За да се оценят промените в антибактериалната активност, причинени от агрегацията на частици, първо, тяхната минимална инхибираща концентрация (MIC) се определя чрез микроразреждане в 96-ямкова микротитърна плака.Към 50 μL стандартизирана клетъчна суспензия (5 × 104 клетки/mL в среда RPMI 1640), добавете 50 μL суспензия от сребърни наночастици и серийно разредете два пъти концентрацията (в гореспоменатата среда диапазонът е 0 и 75 ppm, т.е. контролната проба съдържа 50 μL клетъчна суспензия и 50 μL среда без наночастици).След това плочата се инкубира при 30°С в продължение на 48 часа и оптичната плътност на културата се измерва при 620 nm с помощта на четец на плочи SPECTROstar Nano (BMG LabTech, Offenburg, Германия).Експериментът се провежда три пъти в три екземпляра.
С изключение на това, че по това време бяха използвани 50 μL проби от единични агрегирани наночастици, същата процедура, както беше описана по-горе, беше използвана за изследване на ефекта на агрегацията върху антибактериалната активност върху гореспоменатите щамове.Различни състояния на агрегиране на сребърни наночастици се получават чрез инкубиране на частиците със 150 mM NaCl за различни периоди от време (0, 1,5, 3, 6, 12 и 24 часа) преди обработката на клетките.Суспензия, допълнена с 50 μL среда RPMI 1640, се използва като контрола на растежа, докато за контрол на токсичността се използва суспензия с неагрегирани наночастици.Експериментът се провежда три пъти в три екземпляра.Използвайте GraphPad Prism 7, за да оцените отново крайния резултат, като използвате същия статистически анализ като MTT анализа.
Нивото на агрегация на най-малките частици (AgNP-I) е характеризирано и резултатите бяха частично публикувани в предишната ни работа, но за по-добро сравнение всички частици бяха щателно проверени.Експерименталните данни са събрани и обсъдени в следващите раздели.Три размера на AgNP.19
Измерванията, извършени от TEM, UV-Vis и DLS, потвърдиха успешния синтез на всички AgNP проби (Фигура 2A-D).Според първия ред на фигура 2, най-малката частица (AgNP-I) показва еднаква сферична морфология със среден диаметър от около 10 nm.Методът на растеж, медииран от семена, също така осигурява AgNP-II и AgNP-III с различни диапазони на размер със среден диаметър на частиците съответно приблизително 20 nm и 50 nm.Според стандартното отклонение на разпределението на частиците размерите на трите проби не се припокриват, което е важно за техния сравнителен анализ.Чрез сравняване на средното аспектно съотношение и съотношението на тънкост на 2D проекции на частици, базирани на ТЕМ, се приема, че сферичността на частиците се оценява от приставката за филтър за форма на ImageJ (Фигура 2E).43 Според анализа на формата на частиците, тяхното аспектно съотношение (голяма страна/къса страна на най-малкия ограничаващ правоъгълник) не се влияе от растежа на частиците и тяхното съотношение на тънкост (измерената площ на съответния идеален кръг/теоретична площ ) постепенно намалява.Това води до все повече и повече полиедрични частици, които са идеално кръгли на теория, съответстващи на коефициент на тънкост 1.
Фигура 2 Изображение от трансмисионен електронен микроскоп (TEM) (A), модел на електронна дифракция (ED) (B), хистограма на разпределението на размера (C), характерен ултравиолетово видим (UV-Vis) абсорбционен спектър на светлина (D) и среден флуиден цитрат -терминираните сребърни наночастици с механичен диаметър (Z-среден), зета потенциал, аспектно съотношение и съотношение на дебелина (E) имат три различни диапазона на размер: AgNP-I е 10 nm (горен ред), AgNP -II е 20 nm (среден ред). ), AgNP-III (долния ред) е 50 nm.
Въпреки че цикличният характер на метода на растеж повлиява до известна степен формата на частиците, което води до по-малката сферичност на по-големите AgNP, и трите проби остават квазисферични.Освен това, както е показано в модела на електронна дифракция на Фигура 2B, нанокристалността на частиците не е засегната.Забележимият дифракционен пръстен, който може да бъде свързан с (111), (220), (200) и (311) индексите на Милър на среброто, е много в съответствие с научната литература и нашите предишни приноси.9, 19,44 Фрагментацията на пръстена на Дебай-Шерер на AgNP-II и AgNP-III се дължи на факта, че ED изображението се улавя при същото увеличение, така че с увеличаването на размера на частиците броят на дифрактираните частици на единица площ се увеличава и намалява.
Известно е, че размерът и формата на наночастиците влияят на биологичната активност.3,45 Зависещата от формата каталитична и биологична активност може да се обясни с факта, че различните форми са склонни да пролиферират определени кристални повърхности (с различни индекси на Милър), а тези кристални повърхности имат различни дейности.45,46 Тъй като приготвените частици осигуряват сходни ED резултати, съответстващи на много сходни кристални характеристики, може да се предположи, че в нашите последващи експерименти за колоидна стабилност и биологична активност, всички наблюдавани разлики трябва да се дължат на размера на наночастиците, а не на свойствата, свързани с формата.
Резултатите от UV-Vis, обобщени на Фигура 2D, допълнително подчертават преобладаващата сферична природа на синтезирания AgNP, тъй като SPR пиковете и на трите проби са около 400 nm, което е характерна стойност за сферичните сребърни наночастици.29,30 Уловените спектри също потвърждават успешния медииран от семена растеж на наносребро.Тъй като размерът на частиците се увеличава, дължината на вълната, съответстваща на максималното поглъщане на светлина от AgNP-II - по-забележимо - Според литературата, AgNP-III е претърпял червено отместване.6,29
По отношение на първоначалната колоидна стабилност на системата AgNP, DLS се използва за измерване на средния хидродинамичен диаметър и зета потенциал на частиците при рН 7,2.Резултатите, изобразени на фигура 2E, показват, че AgNP-III има по-висока колоидна стабилност от AgNP-I или AgNP-II, тъй като общите насоки показват, че зета потенциал от 30 mV абсолютен е необходим за дългосрочна колоидна стабилност. Тази констатация се подкрепя допълнително, когато средната стойност на Z (получена като среден хидродинамичен диаметър на свободни и агрегирани частици) се сравнява с основния размер на частиците, получен чрез ТЕМ, тъй като колкото по-близки са двете стойности, толкова по-мека е степента на събиране в пробата.Всъщност средната стойност на Z на AgNP-I и AgNP-II е сравнително по-висока от техния основен размер на частиците, оценен чрез ТЕМ, така че в сравнение с AgNP-III, се предвижда тези проби да са по-склонни да се агрегират, където силно отрицателният зета потенциал е придружено от близък размер Средната стойност на Z.
Обяснението на този феномен може да бъде двойно.От една страна, концентрацията на цитрат се поддържа на подобно ниво във всички етапи на синтез, осигурявайки относително голямо количество заредени повърхностни групи, за да се предотврати намаляването на специфичната повърхност на растящите частици.Въпреки това, според Levak et al., малки молекули като цитрат могат лесно да бъдат заменени от биомолекули на повърхността на наночастиците.В този случай колоидната стабилност ще се определя от короната на произведените биомолекули.31 Тъй като това поведение беше наблюдавано и при нашите измервания на агрегация (обсъдени по-подробно по-късно), ограничаването на цитрат само по себе си не може да обясни това явление.
От друга страна, размерът на частиците е обратно пропорционален на тенденцията на агрегиране на нанометрово ниво.Това се подкрепя главно от традиционния метод на Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO), където привличането на частици се описва като сбор от привличащи и отблъскващи сили между частиците.Според He et al., максималната стойност на енергийната крива DLVO намалява с размера на наночастиците в наночастиците хематит, което улеснява достигането на минималната първична енергия, като по този начин насърчава необратимата агрегация (кондензация).47 Въпреки това се спекулира, че има други аспекти извън ограниченията на теорията за DLVO.Въпреки че гравитацията на Ван дер Ваалс и електростатичното двуслойно отблъскване са сходни с увеличаване на размера на частиците, преглед на Hotze et al.предполага, че има по-силен ефект върху агрегацията, отколкото позволява DLVO.14 Те вярват, че кривината на повърхността на наночастиците вече не може да бъде оценена като плоска повърхност, което прави математическата оценка неприложима.Освен това, тъй като размерът на частиците намалява, процентът на атомите, присъстващи на повърхността, става по-висок, което води до електронна структура и поведение на повърхностния заряд.И повърхностната реактивност се променя, което може да доведе до намаляване на заряда в двойния електрически слой и да насърчи агрегацията.
Когато сравнявахме резултатите от DLS на AgNP-I, AgNP-II и AgNP-III на Фигура 3, наблюдавахме, че и трите проби показват подобно рН, предизвикващо агрегация.Силно кисела среда (рН 3) измества зета потенциала на пробата до 0 mV, което кара частиците да образуват агрегати с микронни размери, докато алкалното рН измества своя зета потенциал към по-голяма отрицателна стойност, където частиците образуват по-малки агрегати (рН 5 ).И 7.2) ), или остават напълно неагрегирани (pH 9).Бяха наблюдавани и някои важни разлики между различните проби.По време на експеримента AgNP-I се оказа най-чувствителен към предизвиканите от pH промени на зета потенциала, тъй като зета потенциалът на тези частици е намален при pH 7,2 в сравнение с pH 9, докато AgNP-II и AgNP-III показват само A значителна промяна в ζ е около pH 3. В допълнение, AgNP-II показа по-бавни промени и умерен зета потенциал, докато AgNP-III показа най-лекото поведение от трите, тъй като системата показа най-високата абсолютна зета стойност и бавно движение на тенденцията, което показва AgNP-III Най-устойчив на pH-индуцирана агрегация.Тези резултати са в съответствие с резултатите от измерването на средния хидродинамичен диаметър.Като се има предвид размера на частиците на техните праймери, AgNP-I показаха постоянна постепенна агрегация при всички стойности на рН, най-вероятно поради фона на 10 mM NaCl, докато AgNP-II и AgNP-III показаха значително събиране само при pH 3.Най-интересната разлика е, че въпреки големия си размер на наночастиците, AgNP-III образува най-малките агрегати при pH 3 за 24 часа, подчертавайки неговите антиагрегационни свойства.Чрез разделяне на средния Z на AgNPs при pH 3 след 24 часа на стойността на подготвената проба, може да се наблюдава, че относителните агрегатни размери на AgNP-I и AgNP-II са се увеличили с 50 пъти, 42 пъти и 22 пъти , съответно.III.
Фигура 3 Резултатите от динамичното разсейване на светлината на проба от сребърни наночастици с цитратен край с нарастващ размер (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II и 50 nm: AgNP-III) се изразяват като среден хидродинамичен диаметър (Z средно ) (вдясно) При различни условия на pH зета потенциалът (вляво) се променя в рамките на 24 часа.
Наблюдаваното pH-зависимо агрегиране също повлиява характерния повърхностен плазмонен резонанс (SPR) на пробите AgNP, както се вижда от техните UV-Vis спектри.Съгласно допълнителна фигура S1, агрегацията на всичките три суспензии от сребърни наночастици е последвана от намаляване на интензитета на техните SPR пикове и умерено червено изместване.Степента на тези промени като функция на pH е в съответствие със степента на агрегация, предвидена от резултатите от DLS, но са наблюдавани някои интересни тенденции.Противно на интуицията се оказва, че средно големият AgNP-II е най-чувствителен към промените на SPR, докато другите две проби са по-малко чувствителни.В изследването на SPR 50 nm е теоретичната граница на размера на частиците, която се използва за разграничаване на частиците въз основа на техните диелектрични свойства.Частиците, по-малки от 50 nm (AgNP-I и AgNP-II), могат да бъдат описани като прости диелектрични диполи, докато частиците, които достигат или надвишават тази граница (AgNP-III), имат по-сложни диелектрични свойства и техният резонанс Лентата се разделя на мултимодални промени .В случай на две по-малки проби от частици, AgNP могат да се разглеждат като прости диполи и плазмата може лесно да се припокрива.Тъй като размерът на частиците се увеличава, това свързване по същество произвежда по-голяма плазма, което може да обясни наблюдаваната по-висока чувствителност.29 Въпреки това, за най-големите частици простата диполна оценка не е валидна, когато могат да възникнат и други състояния на свързване, което може да обясни намалената тенденция на AgNP-III да показва спектрални промени.29
При нашите експериментални условия е доказано, че стойността на pH има дълбок ефект върху колоидната стабилност на покрити с цитрат сребърни наночастици с различни размери.В тези системи стабилността се осигурява от отрицателно заредените -COO- групи на повърхността на AgNPs.Карбоксилатната функционална група на цитратния йон е протонирана в голям брой Н+ йони, така че генерираната карбоксилна група вече не може да осигури електростатично отблъскване между частиците, както е показано в горния ред на Фигура 4. Съгласно принципа на Le Chatelier, AgNP пробите бързо се агрегират при pH 3, но постепенно стават все по-стабилни с повишаването на pH.
Фигура 4 Схематичен механизъм на взаимодействие на повърхността, дефиниран чрез агрегация при различно рН (горен ред), концентрация на NaCl (среден ред) и биомолекули (долен ред).
Съгласно Фигура 5, колоидната стабилност в AgNP суспензии с различни размери също беше изследвана при нарастващи концентрации на сол.Въз основа на зета потенциала, увеличеният размер на наночастиците в тези системи AgNP с цитратен край отново осигурява повишена устойчивост на външни влияния от NaCl.В AgNP-I, 10 mM NaCl е достатъчен, за да предизвика лека агрегация, а концентрация на сол от 50 mM осигурява много подобни резултати.В AgNP-II и AgNP-III, 10 mM NaCl не влияе значително на зета потенциала, тъй като техните стойности остават при (AgNP-II) или под (AgNP-III) -30 mV.Увеличаването на концентрацията на NaCl до 50 mM и накрая до 150 mM NaCl е достатъчно за значително намаляване на абсолютната стойност на зета потенциала във всички проби, въпреки че по-големите частици запазват повече отрицателен заряд.Тези резултати са в съответствие с очаквания среден хидродинамичен диаметър на AgNPs;средните Z линии на тенденция, измерени на 10, 50 и 150 mM NaCl, показват различни, постепенно нарастващи стойности.И накрая, агрегати с микронни размери бяха открити и при трите 150 тМ експеримента.
Фигура 5 Резултатите от динамичното разсейване на светлината на пробата от сребърни наночастици с цитратен край с нарастващ размер (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II и 50 nm: AgNP-III) се изразяват като среден хидродинамичен диаметър (Z средно ) (вдясно) и зета потенциал (вляво) се променят в рамките на 24 часа при различни концентрации на NaCl.
Резултатите от UV-Vis в допълнителна фигура S2 показват, че SPR от 50 и 150 mM NaCl във всичките три проби има моментално и значително намаление.Това може да се обясни с DLS, тъй като агрегацията на базата на NaCl се случва по-бързо от pH-зависимите експерименти, което се обяснява с голямата разлика между ранните (0, 1, 5 и 3 часа) измервания.В допълнение, увеличаването на концентрацията на сол също ще увеличи относителната диелектрична проницаемост на експерименталната среда, което ще има дълбок ефект върху повърхностния плазмонен резонанс.29
Ефектът на NaCl е обобщен в средния ред на фигура 4. Като цяло може да се заключи, че увеличаването на концентрацията на натриев хлорид има подобен ефект като увеличаването на киселинността, тъй като Na+ йоните имат тенденция да се координират около карбоксилатните групи, потискане на AgNP с отрицателен зета потенциал.В допълнение, 150 mM NaCl произвежда агрегати с микронни размери във всичките три проби, което показва, че физиологичната концентрация на електролита е вредна за колоидната стабилност на цитратно-терминирани AgNPs.Като се вземе предвид критичната концентрация на кондензация (CCC) на NaCl върху подобни AgNP системи, тези резултати могат да бъдат умело поставени в съответната литература.Huynh и др.изчислява, че CCC на NaCl за сребърни наночастици с цитратен край със среден диаметър 71 nm е 47,6 mM, докато El Badawy et al.наблюдава, че CCC на 10 nm AgNP с цитратно покритие е 70 mM.10, 16 В допълнение, значително високият CCC от около 300 mM беше измерен от He et al., което причини техния метод на синтез да бъде различен от споменатата по-рано публикация.48 Въпреки че настоящият принос не е насочен към цялостен анализ на тези стойности, тъй като нашите експериментални условия се увеличават в сложността на цялото изследване, биологично значимата концентрация на NaCl от 50 mM, особено 150 mM NaCl, изглежда доста висока.Индуцирана коагулация, обясняваща откритите силни промени.
Следващата стъпка в експеримента за полимеризация е да се използват прости, но биологично значими молекули за симулиране на взаимодействия наночастици-биомолекули.Въз основа на резултатите от DLS (фигури 6 и 7) и UV-Vis (допълнителни фигури S3 и S4), могат да се направят някои общи заключения.При нашите експериментални условия, изследваните молекули глюкоза и глутамин няма да индуцират агрегация в която и да е AgNP система, тъй като Z-средната тенденция е тясно свързана със съответната референтна стойност на измерване.Въпреки че тяхното присъствие не влияе на агрегацията, експерименталните резултати показват, че тези молекули са частично адсорбирани на повърхността на AgNP.Най-забележителният резултат в подкрепа на това мнение е наблюдаваната промяна в абсорбцията на светлина.Въпреки че AgNP-I не проявява значими промени в дължината на вълната или интензитета, може да се наблюдава по-ясно чрез измерване на по-големи частици, което най-вероятно се дължи на по-голямата оптична чувствителност, спомената по-рано.Независимо от концентрацията, глюкозата може да причини по-голямо червено изместване след 1,5 часа в сравнение с контролното измерване, което е около 40 nm в AgNP-II и около 10 nm в AgNP-III, което доказва появата на повърхностни взаимодействия.Глутаминът показва подобна тенденция, но промяната не е толкова очевидна.Освен това си струва да се спомене, че глутаминът може да намали абсолютния зета потенциал на средни и големи частици.Въпреки това, тъй като тези зета промени изглежда не влияят на нивото на агрегация, може да се спекулира, че дори малки биомолекули като глутамин могат да осигурят определена степен на пространствено отблъскване между частиците.
Фигура 6 Резултатите от динамичното разсейване на светлината на проби от сребърни наночастици с цитратен край с нарастващ размер (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II и 50 nm: AgNP-III) се изразяват като среден хидродинамичен диаметър (Z средно) (вдясно) При външни условия на различни концентрации на глюкоза, зета потенциалът (вляво) се променя в рамките на 24 часа.
Фигура 7 Резултатите от динамичното разсейване на светлината на проба от сребърни наночастици с цитратен край с нарастващ размер (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II и 50 nm: AgNP-III) се изразяват като среден хидродинамичен диаметър (Z средно ) (вдясно) В присъствието на глутамин зета потенциалът (вляво) се променя в рамките на 24 часа.
Накратко, малки биомолекули като глюкоза и глутамин не влияят на колоидната стабилност при измерената концентрация: въпреки че влияят на зета потенциала и UV-Vis резултатите в различна степен, Z средните резултати не са последователни.Това показва, че повърхностната адсорбция на молекулите инхибира електростатичното отблъскване, но в същото време осигурява стабилност на размерите.
За да свържем предишните резултати с предишните резултати и да симулираме по-умело биологичните условия, ние избрахме някои от най-често използваните компоненти на клетъчната култура и ги използвахме като експериментални условия за изследване на стабилността на колоидите AgNP.В целия in vitro експеримент една от най-важните функции на DMEM като среда е да установи необходимите осмотични условия, но от химическа гледна точка това е сложен солев разтвор с обща йонна сила, подобна на 150 mM NaCl .40 Що се отнася до FBS, това е сложна смес от биомолекули - главно протеини - от гледна точка на повърхностна адсорбция, има някои прилики с експерименталните резултати за глюкоза и глутамин, въпреки химичния състав и разнообразието. Полът е много по-сложен.19 DLS и UV-Видимите резултати, показани съответно на фигура 8 и допълнителна фигура S5, могат да бъдат обяснени чрез изследване на химическия състав на тези материали и съпоставянето им с измерванията в предишния раздел.
Фигура 8 Резултатите от динамичното разсейване на светлината на проба от сребърни наночастици с цитратен край с нарастващ размер (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II и 50 nm: AgNP-III) се изразяват като среден хидродинамичен диаметър (Z средно ) (вдясно) В присъствието на компоненти на клетъчна култура DMEM и FBS, зета потенциалът (вляво) се променя в рамките на 24 часа.
Разреждането на AgNP с различни размери в DMEM има подобен ефект върху колоидната стабилност на наблюдавания в присъствието на високи концентрации на NaCl.Дисперсията на AgNP в 50 v/v% DMEM показа, че агрегацията в голям мащаб е открита с увеличаването на зета потенциала и Z-средната стойност и рязкото намаляване на интензитета на SPR.Струва си да се отбележи, че максималният размер на агрегатите, предизвикан от DMEM след 24 часа, е обратно пропорционален на размера на наночастиците на праймера.
Взаимодействието между FBS и AgNP е подобно на това, наблюдавано в присъствието на по-малки молекули като глюкоза и глутамин, но ефектът е по-силен.Средната Z на частиците остава незасегната, докато се открива увеличение на зета потенциала.Пикът на SPR показва леко червено изместване, но може би по-интересното е, че интензитетът на SPR не намалява толкова значително, колкото при контролното измерване.Тези резултати могат да се обяснят с вродената адсорбция на макромолекули върху повърхността на наночастиците (долния ред на Фигура 4), която сега се разбира като образуване на биомолекулна корона в тялото.49