JavaScript este în prezent dezactivat în browserul dvs.Când javascript este dezactivat, unele funcții ale acestui site web nu vor funcționa.
Înregistrați-vă detaliile specifice și medicamentele specifice de interes și vom potrivi informațiile pe care le furnizați cu articolele din baza noastră de date extinsă și vă vom trimite o copie PDF prin e-mail în timp util.
Nanoparticulele mai mici sunt întotdeauna mai bune?Înțelegeți efectele biologice ale agregării dependente de dimensiune a nanoparticulelor de argint în condiții relevante din punct de vedere biologic
Autori: Bélteky P, Rónavári A, Zakupszky D, Boka E, Igaz N, Szerencsés B, Pfeiffer I, Vágvölgyi C, Kiricsi M, Kónya Z
Péter Bélteky,1,* Andrea Rónavári,1,* Dalma Zakupszky,1 Eszter Boka,1 Nóra Igaz,2 Bettina Szerencsés,3 Ilona Pfeiffer,3 Csaba Vágvölgyi,3 Mónika Kiricsi de Chimia Mediului, Ungaria, Facultatea de Științe și Informatică din Ungaria , Universitatea din Szeged;2 Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Facultatea de Științe și Informații, Universitatea din Szeged, Ungaria;3 Departamentul de Microbiologie, Facultatea de Științe și Informații, Universitatea din Szeged, Ungaria;4MTA-SZTE Reaction Kinetics and Surface Chemistry Research Group, Szeged, Ungaria* Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare.Comunicare: Zoltán Kónya Departamentul de Chimie Aplicată și a Mediului, Facultatea de Științe și Informatică, Universitatea din Szeged, Piața Rerrich 1, Szeged, H-6720, Ungaria Telefon +36 62 544620 E-mail [Protecție prin e-mail] Scop: Nanoparticulele de argint (AgNP) sunt unul dintre cele mai frecvent studiate nanomateriale, în special datorită aplicațiilor lor biomedicale.Cu toate acestea, din cauza agregării nanoparticulelor, excelenta lor citotoxicitate și activitatea antibacteriană sunt adesea compromise în mediile biologice.În această lucrare, au fost studiate comportamentul de agregare și activitățile biologice aferente a trei probe diferite de nanoparticule de argint terminate cu citrat, cu un diametru mediu de 10, 20 și 50 nm.Metodă: Utilizați microscopul electronic cu transmisie pentru a sintetiza și caracteriza nanoparticulele, evaluați comportamentul lor de agregare la diferite valori de pH, concentrații de NaCl, glucoză și glutamină prin împrăștiere dinamică a luminii și spectroscopie ultravioletă-vizibilă.În plus, componentele din mediul de cultură celulară, cum ar fi Dulbecco, îmbunătățesc comportamentul de agregare în Eagle Medium și Fetal Calf Serum.Rezultate: Rezultatele arată că pH-ul acid și conținutul de electroliți fiziologic induc, în general, agregarea la scară de microni, care poate fi mediată de formarea coroanei biomoleculare.Este de remarcat faptul că particulele mai mari prezintă o rezistență mai mare la influențele externe decât omologii lor mai mici.Testele de citotoxicitate și antibacteriene in vitro au fost efectuate prin tratarea celulelor cu agregate de nanoparticule în diferite stadii de agregare.Concluzie: Rezultatele noastre relevă o corelație profundă între stabilitatea coloidală și toxicitatea AgNP-urilor, deoarece agregarea extremă duce la pierderea completă a activității biologice.Gradul mai mare de anti-agregare observat pentru particulele mai mari are un impact semnificativ asupra toxicității in vitro, deoarece astfel de probe păstrează mai multă activitate antimicrobiană și celule de mamifere.Aceste constatări conduc la concluzia că, în ciuda opiniei generale din literatura de specialitate, țintirea celor mai mici nanoparticule posibile poate să nu fie cea mai bună cale de acțiune.Cuvinte cheie: creștere mediată de semințe, stabilitate coloidală, comportament de agregare dependent de mărime, toxicitate daune de agregare
Pe măsură ce cererea și producția de nanomateriale continuă să crească, se acordă din ce în ce mai multă atenție biosecurității sau activității lor biologice.Nanoparticulele de argint (AgNPs) sunt unul dintre cei mai des sintetizați, cercetați și utilizați reprezentanți ai acestei clase de materiale datorită proprietăților lor catalitice, optice și biologice excelente.1 În general, se crede că caracteristicile unice ale nanomaterialelor (inclusiv AgNP) sunt atribuite în principal suprafeței lor specifice mari.Prin urmare, problema inevitabil este orice proces care afectează această caracteristică cheie, cum ar fi dimensiunea particulelor, acoperirea suprafeței sau agregarea, dacă va deteriora grav proprietățile nanoparticulelor care sunt critice pentru aplicații specifice.
Efectele dimensiunii particulelor și ale stabilizatorilor sunt subiecte care au fost relativ bine documentate în literatură.De exemplu, opinia general acceptată este că nanoparticulele mai mici sunt mai toxice decât nanoparticulele mai mari.2 În concordanță cu literatura generală, studiile noastre anterioare au demonstrat activitatea dependentă de dimensiune a nanoargintului asupra celulelor și microorganismelor de mamifere.3– 5 Acoperirea suprafeței este un alt atribut care are o influență largă asupra proprietăților nanomaterialelor.Doar prin adăugarea sau modificarea stabilizatorilor pe suprafața sa, același nanomaterial poate avea proprietăți fizice, chimice și biologice complet diferite.Aplicarea agenților de acoperire se realizează cel mai adesea ca parte a sintezei nanoparticulelor.De exemplu, nanoparticulele de argint terminate cu citrat sunt una dintre cele mai relevante AgNP din cercetare, care sunt sintetizate prin reducerea sărurilor de argint într-o soluție de stabilizator selectată ca mediu de reacție.6 Citratul poate profita cu ușurință de costul scăzut, disponibilitatea, biocompatibilitatea și afinitatea puternică pentru argint, care se poate reflecta în diferite interacțiuni propuse, de la adsorbția de suprafață reversibilă la interacțiunile ionice.Moleculele mici și ionii poliatomici aproape de 7,8, cum ar fi citrații, polimerii, polielectroliții și agenții biologici sunt, de asemenea, utilizați în mod obișnuit pentru a stabiliza nano-argint și a efectua funcționalizări unice asupra acestuia.9-12
Deși posibilitatea de modificare a activității nanoparticulelor prin acoperirea intenționată a suprafeței este un domeniu foarte interesant, rolul principal al acestei acoperiri de suprafață este neglijabil, oferind stabilitate coloidală pentru sistemul de nanoparticule.Suprafața specifică mare a nanomaterialelor va produce energie de suprafață mare, ceea ce împiedică capacitatea termodinamică a sistemului de a atinge energia minimă.13 Fără o stabilizare adecvată, acest lucru poate duce la aglomerarea nanomaterialelor.Agregarea este formarea de agregate de particule de diferite forme și dimensiuni, care are loc atunci când particulele dispersate se întâlnesc și interacțiunile termodinamice actuale permit particulelor să adere între ele.Prin urmare, stabilizatorii sunt utilizați pentru a preveni agregarea prin introducerea unei forțe de respingere suficient de mare între particule pentru a contracara atracția lor termodinamică.14
Deși subiectul dimensiunii particulelor și al acoperirii suprafeței a fost explorat în detaliu în contextul reglementării activităților biologice declanșate de nanoparticule, agregarea particulelor este un domeniu în mare măsură neglijat.Nu există aproape niciun studiu amănunțit pentru a rezolva stabilitatea coloidală a nanoparticulelor în condiții relevante din punct de vedere biologic.10,15-17 În plus, această contribuție este deosebit de rară, acolo unde a fost studiată și toxicitatea asociată cu agregarea, chiar dacă poate provoca reacții adverse, cum ar fi tromboza vasculară, sau pierderea caracteristicilor dorite, cum ar fi toxicitatea acesteia, cum ar fi prezentate în Figura 1.18, 19 prezentate.De fapt, unul dintre puținele mecanisme cunoscute de rezistență la nanoparticulele de argint este legat de agregare, deoarece se raportează că anumite tulpini de E. coli și Pseudomonas aeruginosa își reduc sensibilitatea la nano-argint prin exprimarea proteinei flagelinei, flagelina.Are o mare afinitate pentru argint, inducând astfel agregarea.20
Există mai multe mecanisme diferite legate de toxicitatea nanoparticulelor de argint, iar agregarea afectează toate aceste mecanisme.Cea mai discutată metodă a activității biologice AgNP, uneori denumită mecanismul „Calului Troian”, consideră AgNP-urile ca purtători Ag+.1,21 Mecanismul calului troian poate asigura o creștere mare a concentrației locale de Ag+, ceea ce duce la generarea de ROS și depolarizarea membranei.22-24 Agregarea poate afecta eliberarea de Ag+, afectând astfel toxicitatea, deoarece reduce suprafața activă efectivă unde ionii de argint pot fi oxidați și dizolvați.Cu toate acestea, AgNP-urile nu vor prezenta doar toxicitate prin eliberarea de ioni.Trebuie luate în considerare multe interacțiuni legate de dimensiune și morfologie.Printre acestea, dimensiunea și forma suprafeței nanoparticulelor sunt caracteristicile definitorii.4,25 Colecția acestor mecanisme poate fi clasificată drept „mecanisme de toxicitate indusă”.Există potențial multe reacții mitocondriale și membranare de suprafață care pot deteriora organele și pot provoca moartea celulelor.25-27 Deoarece formarea agregatelor afectează în mod natural dimensiunea și forma obiectelor care conțin argint recunoscute de sistemele vii, aceste interacțiuni pot fi, de asemenea, afectate.
În lucrarea noastră anterioară despre agregarea nanoparticulelor de argint, am demonstrat o procedură de screening eficientă constând din experimente chimice și biologice in vitro pentru a studia această problemă.19 Dynamic Light Scattering (DLS) este tehnica preferată pentru aceste tipuri de inspecții, deoarece materialul poate împrăștia fotoni la o lungime de undă comparabilă cu dimensiunea particulelor sale.Deoarece viteza de mișcare browniană a particulelor din mediul lichid este legată de dimensiune, modificarea intensității luminii împrăștiate poate fi utilizată pentru a determina diametrul hidrodinamic mediu (Z-mean) al probei lichide.28 În plus, prin aplicarea unei tensiuni eșantionului, potențialul zeta (potențialul ζ) al nanoparticulei poate fi măsurat în mod similar cu valoarea medie Z.13,28 Dacă valoarea absolută a potențialului zeta este suficient de mare (conform ghidurilor generale> ±30 mV), aceasta va genera repulsie electrostatică puternică între particule pentru a contracara agregarea.Rezonanța plasmonică de suprafață caracteristică (SPR) este un fenomen optic unic, atribuit în principal nanoparticulelor de metale prețioase (în principal Au și Ag).29 Pe baza oscilațiilor electronice (plasmonii de suprafață) ale acestor materiale la scară nanometrică, se știe că AgNP-urile sferice au un vârf caracteristic de absorbție UV-Vis aproape de 400 nm.30 Schimbarea intensității și a lungimii de undă a particulelor sunt utilizate pentru a suplimenta rezultatele DLS, deoarece această metodă poate fi utilizată pentru a detecta agregarea nanoparticulelor și adsorbția de suprafață a biomoleculelor.
Pe baza informațiilor obținute, viabilitatea celulară (MTT) și testele antibacteriene sunt efectuate într-un mod în care toxicitatea AgNP este descrisă ca o funcție a nivelului de agregare, mai degrabă decât (factorul cel mai frecvent utilizat) concentrația de nanoparticule.Această metodă unică ne permite să demonstrăm importanța profundă a nivelului de agregare în activitatea biologică, deoarece, de exemplu, AgNP-urile terminate cu citrat își pierd complet activitatea biologică în câteva ore din cauza agregării.19
În lucrarea actuală, ne propunem să extindem foarte mult contribuțiile noastre anterioare în stabilitatea coloizilor înrudiți cu bio și impactul acestora asupra activității biologice, prin studierea efectului dimensiunii nanoparticulelor asupra agregării nanoparticulelor.Acesta este, fără îndoială, unul dintre studiile nanoparticulelor.O perspectivă de profil mai înalt și 31 Pentru a investiga această problemă, a fost utilizată o metodă de creștere mediată de semințe pentru a produce AgNP-uri terminate cu citrat în trei intervale de dimensiuni diferite (10, 20 și 50 nm).6,32 ca una dintre cele mai comune metode.Pentru nanomaterialele care sunt utilizate pe scară largă și în mod obișnuit în aplicații medicale, AgNP-urile terminate cu citrat de diferite dimensiuni sunt selectate pentru a studia posibila dependență de dimensiune a proprietăților biologice legate de agregare ale nanoargintului.După sintetizarea AgNP-urilor de diferite dimensiuni, am caracterizat probele produse prin microscopie electronică de transmisie (TEM) și apoi am examinat particulele utilizând procedura de screening menționată mai sus.În plus, în prezența culturilor celulare in vitro, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) și Fetal Bovine Serum (FBS), comportamentul de agregare dependent de mărime și comportamentul acestuia au fost evaluate la diferite valori ale pH-ului, NaCl, glucoză și concentrații de glutamină.Caracteristicile citotoxicității sunt determinate în condiții cuprinzătoare.Consensul științific indică faptul că, în general, particulele mai mici sunt de preferat;investigația noastră oferă o platformă chimică și biologică pentru a determina dacă acesta este cazul.
Trei nanoparticule de argint cu diferite game de dimensiuni au fost preparate prin metoda de creștere mediată de semințe propusă de Wan și colab., cu ușoare ajustări.6 Această metodă se bazează pe reducerea chimică, folosind azotat de argint (AgNO3) ca sursă de argint, borohidrură de sodiu (NaBH4) ca agent reducător și citrat de sodiu ca stabilizator.Mai întâi, se prepară 75 ml de soluție apoasă de citrat 9 mM din citrat de sodiu dihidrat (Na3C6H5O7 x 2H2O) și se încălzește la 70°C.Apoi, s-au adăugat 2 ml de soluție de AgNO3 1% g/v la mediul de reacție și apoi soluția de borohidrură de sodiu proaspăt preparată (2 ml 0,1% g/v) a fost turnată în amestec prin picurare.Suspensia galben-maro rezultată a fost menţinută la 70°C cu agitare puternică timp de 1 oră şi apoi răcită la temperatura camerei.Proba rezultată (denumită de acum înainte AgNP-I) este utilizată ca bază pentru creșterea mediată de semințe în următoarea etapă de sinteză.
Pentru a sintetiza o suspensie de particule de dimensiuni medii (denumită AgNP-II), încălziți 90 mL soluție de citrat 7,6 mM la 80°C, amestecați-o cu 10 mL AgNP-I și apoi amestecați 2 mL 1% g/v Soluția de AgNO3 a fost menținută sub agitare mecanică puternică timp de 1 oră și apoi proba a fost răcită la temperatura camerei.
Pentru cea mai mare particulă (AgNP-III), repetați același proces de creștere, dar în acest caz, utilizați 10 ml de AgNP-II ca suspensie de semințe.După ce probele ating temperatura camerei, își stabilesc concentrația nominală de Ag pe baza conținutului total de AgNO3 la 150 ppm prin adăugarea sau evaporarea unui solvent suplimentar la 40°C și, în final, le depozitează la 4°C până la utilizarea ulterioară.
Utilizați microscopul electronic cu transmisie (TEM) FEI Tecnai G2 20 X-Twin (FEI Corporate Headquarters, Hillsboro, Oregon, SUA) cu o tensiune de accelerație de 200 kV pentru a examina caracteristicile morfologice ale nanoparticulelor și a captura modelul lor de difracție a electronilor (ED).Cel puțin 15 imagini reprezentative (~ 750 de particule) au fost evaluate folosind pachetul software ImageJ, iar histogramele rezultate (și toate graficele din întregul studiu) au fost create în OriginPro 2018 (OriginLab, Northampton, MA, SUA) 33, 34.
Diametrul hidrodinamic mediu (medie Z), potențialul zeta (potențialul ζ) și rezonanța plasmonică de suprafață caracteristică (SPR) ale probelor au fost măsurate pentru a ilustra proprietățile lor coloidale inițiale.Diametrul hidrodinamic mediu și potențialul zeta al probei au fost măsurate cu instrumentul Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, Marea Britanie) folosind celule capilare pliate de unică folosință la 37±0,1°C.Spectrofotometrul UV-Vis Ocean Optics 355 DH-2000-BAL (Halma PLC, Largo, FL, SUA) a fost utilizat pentru a obține caracteristici SPR caracteristice din spectrele de absorbție UV-Vis ale probelor în intervalul 250-800 nm.
Pe parcursul întregului experiment, au fost efectuate în același timp trei tipuri de măsurare diferite legate de stabilitatea coloidală.Utilizați DLS pentru a măsura diametrul hidrodinamic mediu (media Z) și potențialul zeta (potențialul ζ) al particulelor, deoarece media Z este legată de dimensiunea medie a agregatelor de nanoparticule, iar potențialul zeta indică dacă repulsia electrostatică din sistem este suficient de puternic pentru a compensa atracția Van der Waals dintre nanoparticule.Măsurătorile sunt făcute în trei exemplare, iar abaterea standard a mediei Z și potențialului zeta este calculată de software-ul Zetasizer.Spectrele SPR caracteristice ale particulelor sunt evaluate prin spectroscopie UV-Vis, deoarece modificările intensității maxime și ale lungimii de undă pot indica agregarea și interacțiunile de suprafață.29,35 De fapt, rezonanța plasmonilor de suprafață în metalele prețioase este atât de influentă încât a condus la noi metode de analiză a biomoleculelor.29,36,37 Concentrația AgNP-urilor în amestecul experimental este de aproximativ 10 ppm, iar scopul este de a seta intensitatea absorbției SPR inițiale maxime la 1. Experimentul a fost efectuat într-o manieră dependentă de timp la 0;1,5;3;6;12 și 24 de ore în diferite condiții biologice relevante.Mai multe detalii care descriu experimentul pot fi văzute în lucrarea noastră anterioară.19 Pe scurt, diferite valori ale pH-ului (3; 5; 7,2 și 9), concentrații diferite de clorură de sodiu (10 mM; 50 mM; 150 mM), glucoză (3,9 mM; 6,7 mM) și glutamină (4 mM) și a pregătit, de asemenea, Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) și Fetal Bovine Serum (FBS) (în apă și DMEM) ca sisteme model și a studiat efectele acestora asupra comportamentului de agregare al nanoparticulelor de argint sintetizate.pH Valorile NaCl, glucoza și glutamina sunt evaluate pe baza concentrațiilor fiziologice, în timp ce cantitățile de DMEM și FBS sunt aceleași cu nivelurile utilizate în întregul experiment in vitro.38-42 Toate măsurătorile au fost efectuate la pH 7,2 și 37°C cu o concentrație constantă de sare de fundal de 10 mM NaCl pentru a elimina orice interacțiune cu particule la distanță lungă (cu excepția anumitor experimente legate de pH și NaCl, unde aceste atribute sunt variabilele sub studiu).28 Lista diferitelor condiții este rezumată în Tabelul 1. Experimentul marcat cu † este folosit ca referință și corespunde unei probe care conține 10 mM NaCl și pH 7,2.
Linia celulară de cancer de prostată umană (DU145) și keratinocite umane imortalizate (HaCaT) au fost obținute de la ATCC (Manassas, VA, SUA).Celulele sunt cultivate în mod obișnuit în mediu esențial minim Eagle (DMEM) Dulbecco care conține 4,5 g/L glucoză (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, SUA), suplimentat cu 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 0,01% streptomicina și 0,005% Penicilină (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, SUA).Celulele sunt cultivate într-un incubator la 37°C sub 5% CO2 și 95% umiditate.
Pentru a explora modificările citotoxicității AgNP cauzate de agregarea particulelor într-o manieră dependentă de timp, a fost efectuat un test MTT în două etape.În primul rând, viabilitatea celor două tipuri de celule a fost măsurată după tratamentul cu AgNP-I, AgNP-II și AgNP-III.În acest scop, cele două tipuri de celule au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri la o densitate de 10.000 de celule/godeu și tratate cu trei dimensiuni diferite de nanoparticule de argint în concentrații crescânde în a doua zi.După 24 de ore de tratament, celulele au fost spălate cu PBS și incubate cu 0,5 mg/mL reactiv MTT (SERVA, Heidelberg, Germania) diluat în mediu de cultură timp de 1 oră la 37°C.Cristalele de formazan au fost dizolvate în DMSO (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, SUA), iar absorbția a fost măsurată la 570 nm folosind un cititor de plăci Synergy HTX (BioTek-Ungaria, Budapesta, Ungaria).Valoarea de absorbție a probei martor netratate este considerată a fi rata de supraviețuire de 100%.Efectuați cel puțin 3 experimente folosind patru replici biologice independente.IC50 este calculată dintr-o curbă de răspuns la doză bazată pe rezultatele de vitalitate.
Ulterior, în a doua etapă, prin incubarea particulelor cu 150 mM NaCI pentru diferite perioade de timp (0, 1,5, 3, 6, 12 și 24 de ore) înainte de tratamentul celular, au fost produse diferite stări de agregare a nanoparticulelor de argint.Ulterior, s-a efectuat același test MTT așa cum s-a descris anterior pentru a evalua modificările viabilității celulare afectate de agregarea particulelor.Utilizați GraphPad Prism 7 pentru a evalua rezultatul final, calculați semnificația statistică a experimentului prin testul t nepereche și marcați nivelul acestuia ca * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01), *** (p ≤ 0,001). ) Și **** (p ≤ 0,0001).
Trei dimensiuni diferite de nanoparticule de argint (AgNP-I, AgNP-II și AgNP-III) au fost utilizate pentru susceptibilitatea antibacteriană la Cryptococcus neoformans IFM 5844 (IFM; Centrul de cercetare pentru ciuperci patogene și toxicologie microbiană, Universitatea Chiba) și Bacillus Test megaterium SZMC 6031 (SZMC: Szeged Microbiology Collection) și E. coli SZMC 0582 în mediu RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Co.).Pentru a evalua modificările activității antibacteriene cauzate de agregarea particulelor, în primul rând, concentrația minimă inhibitoare (MIC) a fost determinată prin microdiluare într-o placă de microtitrare cu 96 de godeuri.La 50 μL de suspensie de celule standardizate (5 × 104 celule/mL în mediu RPMI 1640), adăugați 50 μL de suspensie de nanoparticule de argint și diluați în serie de două ori concentrația (în mediul menționat mai sus, intervalul este de 0 și 75 ppm, adică, proba martor conține 50 μL de suspensie celulară și 50 μL de mediu fără nanoparticule).După aceea, placa a fost incubată la 30°C timp de 48 de ore, iar densitatea optică a culturii a fost măsurată la 620 nm folosind un cititor de plăci SPECTROstar Nano (BMG LabTech, Offenburg, Germania).Experimentul a fost efectuat de trei ori în trei exemplare.
Cu excepția faptului că s-au folosit 50 μL de mostre de nanoparticule unice agregate în acest moment, a fost utilizată aceeași procedură ca cea descrisă anterior pentru a examina efectul agregării asupra activității antibacteriene asupra tulpinilor menționate mai sus.Diferite stări de agregare ale nanoparticulelor de argint sunt produse prin incubarea particulelor cu 150 mM NaCl pentru diferite perioade de timp (0, 1,5, 3, 6, 12 și 24 de ore) înainte de procesarea celulelor.O suspensie suplimentată cu 50 μL de mediu RPMI 1640 a fost folosită ca control al creșterii, în timp ce pentru a controla toxicitatea a fost folosită o suspensie cu nanoparticule neagregate.Experimentul a fost efectuat de trei ori în trei exemplare.Utilizați GraphPad Prism 7 pentru a evalua din nou rezultatul final, folosind aceeași analiză statistică ca și analiza MTT.
Nivelul de agregare al celor mai mici particule (AgNP-I) a fost caracterizat, iar rezultatele au fost parțial publicate în lucrarea noastră anterioară, dar pentru o comparație mai bună, toate particulele au fost analizate temeinic.Datele experimentale sunt colectate și discutate în secțiunile următoare.Trei dimensiuni de AgNP.19
Măsurătorile efectuate de TEM, UV-Vis și DLS au verificat sinteza cu succes a tuturor probelor AgNP (Figura 2A-D).Conform primului rând din figura 2, cea mai mică particulă (AgNP-I) prezintă o morfologie sferică uniformă cu un diametru mediu de aproximativ 10 nm.Metoda de creștere mediată de semințe oferă, de asemenea, AgNP-II și AgNP-III cu diferite game de dimensiuni, cu diametre medii ale particulelor de aproximativ 20 nm și, respectiv, 50 nm.Conform abaterii standard a distribuției particulelor, dimensiunile celor trei probe nu se suprapun, ceea ce este important pentru analiza lor comparativă.Comparând raportul mediu de aspect și raportul de subțire al proiecțiilor 2D ale particulelor bazate pe TEM, se presupune că sfericitatea particulelor este evaluată de plug-in-ul de filtru de formă al ImageJ (Figura 2E).43 Conform analizei formei particulelor, raportul lor de aspect (partea mare/partea scurtă a celui mai mic dreptunghi de delimitare) nu este afectat de creșterea particulelor și raportul lor subțiri (aria măsurată a cercului perfect/aria teoretică corespunzătoare). ) scade treptat.Acest lucru are ca rezultat tot mai multe particule poliedrice, care sunt perfect rotunde în teorie, corespunzând unui raport de subțire de 1.
Figura 2 Imaginea microscopului electronic cu transmisie (TEM) (A), modelul de difracție a electronilor (ED) (B), histograma distribuției mărimii (C), spectrul caracteristic de absorbție a luminii ultraviolete-vizibile (UV-Vis) (D) și citrat fluid mediu - nanoparticulele de argint terminate cu diametrul mecanic (Z-medie), potențialul zeta, raportul de aspect și raportul de grosime (E) au trei intervale de dimensiuni diferite: AgNP-I este de 10 nm (rândul de sus), AgNP -II este de 20 nm (rândul din mijloc). ), AgNP-III (rândul de jos) este de 50 nm.
Deși natura ciclică a metodei de creștere a afectat într-o oarecare măsură forma particulelor, rezultând sfericitatea mai mică a AgNP-urilor mai mari, toate cele trei probe au rămas cvasi-sferice.În plus, așa cum se arată în modelul de difracție a electronilor din Figura 2B, nano Cristalinitatea particulelor nu este afectată.Inelul de difracție proeminent - care poate fi corelat cu indicii Miller (111), (220), (200) și (311) ai argintului - este foarte în concordanță cu literatura științifică și cu contribuțiile noastre anterioare.9, 19,44 Fragmentarea inelului Debye-Scherrer al AgNP-II și AgNP-III se datorează faptului că imaginea ED este surprinsă la aceeași mărire, astfel încât, pe măsură ce dimensiunea particulelor crește, numărul de particule difractate per unitatea de suprafață crește și scade.
Se știe că mărimea și forma nanoparticulelor afectează activitatea biologică.3,45 Activitatea catalitică și biologică dependentă de formă poate fi explicată prin faptul că diferitele forme tind să prolifereze anumite fețe de cristal (având diferiți indici Miller), iar aceste fețe de cristal au activități diferite.45,46 Deoarece particulele preparate oferă rezultate ED similare corespunzătoare caracteristicilor cristalelor foarte asemănătoare, se poate presupune că în experimentele noastre ulterioare de stabilitate coloidală și activitate biologică, orice diferență observată ar trebui atribuită mărimii nanoparticulelor, nu proprietăților legate de formă.
Rezultatele UV-Vis rezumate în Figura 2D subliniază și mai mult natura sferică copleșitoare a AgNP sintetizat, deoarece vârfurile SPR ale tuturor celor trei probe sunt în jur de 400 nm, care este o valoare caracteristică a nanoparticulelor sferice de argint.29,30 Spectrele capturate au confirmat, de asemenea, creșterea de succes a nanoargintului mediată de semințe.Pe măsură ce dimensiunea particulelor crește, lungimea de undă corespunzătoare absorbției maxime de lumină a AgNP-II - mai proeminent - Conform literaturii, AgNP-III a experimentat o deplasare spre roșu.6,29
În ceea ce privește stabilitatea coloidală inițială a sistemului AgNP, DLS a fost utilizat pentru a măsura diametrul hidrodinamic mediu și potențialul zeta al particulelor la pH 7,2.Rezultatele prezentate în Figura 2E arată că AgNP-III are o stabilitate coloidală mai mare decât AgNP-I sau AgNP-II, deoarece liniile directoare comune indică faptul că un potențial zeta de 30 mV absolut este necesar pentru stabilitatea coloidală pe termen lung. Această constatare este susținută în continuare atunci când valoarea medie Z (obținută ca diametrul hidrodinamic mediu al particulelor libere și agregate) este comparată cu dimensiunea particulelor primare obținute prin TEM, deoarece cu cât cele două valori sunt mai apropiate, cu atât gradul de adunare în probă este mai blând.De fapt, media Z a AgNP-I și AgNP-II este rezonabil mai mare decât dimensiunea lor principală a particulelor evaluate prin TEM, așa că, în comparație cu AgNP-III, se preconizează că aceste eșantioane vor avea o probabilitate mai mare de agregare, unde potențialul zeta extrem de negativ. este însoțită de o dimensiune apropiată Valoarea medie Z.
Explicația acestui fenomen poate fi dublă.Pe de o parte, concentrația de citrat este menținută la un nivel similar în toate etapele de sinteză, oferind o cantitate relativ mare de grupuri de suprafață încărcate pentru a preveni scăderea suprafeței specifice a particulelor în creștere.Cu toate acestea, conform Levak și colab., moleculele mici precum citratul pot fi schimbate cu ușurință de către biomolecule de pe suprafața nanoparticulelor.În acest caz, stabilitatea coloidală va fi determinată de corona biomoleculelor produse.31 Deoarece acest comportament a fost observat și în măsurătorile noastre de agregare (discutate mai detaliat mai târziu), limitarea citratului în sine nu poate explica acest fenomen.
Pe de altă parte, dimensiunea particulelor este invers proporțională cu tendința de agregare la nivel nanometru.Acest lucru este susținut în principal de metoda tradițională Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO), în care atracția particulelor este descrisă ca suma forțelor atractive și repulsive dintre particule.Potrivit lui He et al., valoarea maximă a curbei de energie DLVO scade odată cu dimensiunea nanoparticulelor din nanoparticulele de hematită, facilitând atingerea energiei primare minime, promovând astfel agregarea ireversibilă (condensare).47 Cu toate acestea, se speculează că există și alte aspecte dincolo de limitările teoriei DLVO.Deși gravitația van der Waals și repulsia electrostatică dublu strat sunt similare cu creșterea dimensiunii particulelor, o revizuire a lui Hotze și colab.propune că are un efect mai puternic asupra agregării decât permite DLVO.14 Ei cred că curbura suprafeței nanoparticulelor nu mai poate fi estimată ca o suprafață plană, ceea ce face estimarea matematică inaplicabilă.În plus, pe măsură ce dimensiunea particulelor scade, procentul de atomi prezenți pe suprafață devine mai mare, ceea ce duce la structura electronică și comportarea sarcinii de suprafață.Și reactivitatea suprafeței se modifică, ceea ce poate duce la o scădere a sarcinii în stratul dublu electric și poate promova agregarea.
Când am comparat rezultatele DLS ale AgNP-I, AgNP-II și AgNP-III din Figura 3, am observat că toate cele trei probe au prezentat un pH similar care determină agregarea.Un mediu puternic acid (pH 3) modifică potențialul zeta al eșantionului la 0 mV, determinând particulele să formeze agregate de dimensiunea micronului, în timp ce pH-ul alcalin își schimbă potențialul zeta la o valoare negativă mai mare, unde particulele formează agregate mai mici (pH 5). ).Și 7,2) ), sau rămân complet neagregate (pH 9).Au fost observate și unele diferențe importante între diferitele probe.Pe parcursul experimentului, AgNP-I s-a dovedit a fi cel mai sensibil la modificările potențialului zeta induse de pH, deoarece potențialul zeta al acestor particule a fost redus la pH 7,2 comparativ cu pH 9, în timp ce AgNP-II și AgNP-III au prezentat doar A. modificarea considerabilă a ζ este în jurul pH-ului 3. În plus, AgNP-II a prezentat modificări mai lente și potențial zeta moderat, în timp ce AgNP-III a arătat cel mai ușor comportament dintre cele trei, deoarece sistemul a arătat cea mai mare valoare zeta absolută și o mișcare lentă a tendinței, indicând AgNP-III Cel mai rezistent la agregarea indusă de pH.Aceste rezultate sunt în concordanță cu rezultatele măsurării diametrului hidrodinamic mediu.Având în vedere dimensiunea particulelor primerilor lor, AgNP-I a arătat o agregare graduală constantă la toate valorile pH-ului, cel mai probabil datorită fondului de NaCl 10 mM, în timp ce AgNP-II și AgNP-III au prezentat semnificativ doar la pH 3 de colectare.Cea mai interesantă diferență este că, în ciuda dimensiunii mari ale nanoparticulelor, AgNP-III formează cele mai mici agregate la pH 3 în 24 de ore, evidențiind proprietățile sale anti-agregare.Prin împărțirea mediei Z a AgNP-urilor la pH 3 după 24 de ore la valoarea probei preparate, se poate observa că dimensiunile agregatelor relative ale AgNP-I și AgNP-II au crescut de 50 de ori, de 42 de ori și de 22 de ori. , respectiv.III.
Figura 3 Rezultatele împrăștierii dinamice a luminii ale eșantionului de nanoparticule de argint terminate cu citrat cu dimensiunea crescândă (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II și 50 nm: AgNP-III) sunt exprimate ca diametrul hidrodinamic mediu (media Z ) (dreapta) În diferite condiții de pH, potențialul zeta (stânga) se modifică în 24 de ore.
Agregarea dependentă de pH-ul observată a afectat, de asemenea, rezonanța plasmonului de suprafață caracteristică (SPR) a probelor AgNP, așa cum este demonstrat de spectrele UV-Vis ale acestora.Conform figurii suplimentare S1, agregarea tuturor celor trei suspensii de nanoparticule de argint este urmată de o reducere a intensității vârfurilor lor SPR și de o schimbare moderată la roșu.Amploarea acestor modificări în funcție de pH este în concordanță cu gradul de agregare prezis de rezultatele DLS, cu toate acestea, au fost observate unele tendințe interesante.Contrar intuiției, se dovedește că AgNP-II de mărime medie este cel mai sensibil la modificările SPR, în timp ce celelalte două probe sunt mai puțin sensibile.În cercetarea SPR, 50 nm este limita teoretică a dimensiunii particulelor, care este utilizată pentru a distinge particulele pe baza proprietăților lor dielectrice.Particulele mai mici de 50 nm (AgNP-I și AgNP-II) pot fi descrise ca dipoli dielectrici simpli, în timp ce particulele care ating sau depășesc această limită (AgNP-III) au proprietăți dielectrice mai complexe, iar rezonanța lor Banda se împarte în modificări multimodale. .În cazul a două probe de particule mai mici, AgNP-urile pot fi considerate dipoli simpli, iar plasma se poate suprapune cu ușurință.Pe măsură ce dimensiunea particulelor crește, această cuplare produce în esență o plasmă mai mare, ceea ce poate explica sensibilitatea mai mare observată.29 Cu toate acestea, pentru cele mai mari particule, estimarea dipolului simplu nu este valabilă atunci când pot apărea și alte stări de cuplare, ceea ce poate explica tendința scăzută a AgNP-III de a indica modificări spectrale.29
În condițiile noastre experimentale, s-a dovedit că valoarea pH-ului are un efect profund asupra stabilității coloidale a nanoparticulelor de argint acoperite cu citrat de diferite dimensiuni.În aceste sisteme, stabilitatea este asigurată de grupările -COO- încărcate negativ de pe suprafața AgNP-urilor.Gruparea funcțională carboxilat a ionului citrat este protonată într-un număr mare de ioni H+, astfel încât gruparea carboxil generată nu mai poate furniza repulsie electrostatică între particule, așa cum se arată în rândul de sus al Figura 4. Conform principiului lui Le Chatelier, AgNP probele se agregează rapid la pH 3, dar treptat devin din ce în ce mai stabile pe măsură ce pH-ul crește.
Figura 4 Mecanismul schematic al interacțiunii suprafeței definit prin agregare sub diferite pH (rândul de sus), concentrația de NaCl (rândul din mijloc) și biomolecule (rândul de jos).
Conform figurii 5, stabilitatea coloidală în suspensii AgNP de diferite dimensiuni a fost, de asemenea, examinată la concentrații crescânde de sare.Pe baza potențialului zeta, dimensiunea crescută a nanoparticulelor în aceste sisteme AgNP terminate cu citrat oferă din nou rezistență sporită la influențele externe ale NaCl.În AgNP-I, 10 mM NaCl este suficient pentru a induce o agregare ușoară, iar o concentrație de sare de 50 mM oferă rezultate foarte similare.În AgNP-II și AgNP-III, 10 mM NaCl nu afectează semnificativ potențialul zeta, deoarece valorile lor rămân la (AgNP-II) sau sub (AgNP-III) -30 mV.Creșterea concentrației de NaCl la 50 mM și în final la 150 mM NaCl este suficientă pentru a reduce semnificativ valoarea absolută a potențialului zeta în toate probele, deși particulele mai mari păstrează o sarcină negativă mai mare.Aceste rezultate sunt în concordanță cu diametrul hidrodinamic mediu așteptat al AgNP-urilor;liniile de tendință medii Z măsurate pe 10, 50 și 150 mM NaCl arată valori diferite, crescând treptat.În cele din urmă, au fost detectate agregate de dimensiunea micronului în toate cele trei experimente de 150 mM.
Figura 5 Rezultatele împrăștierii dinamice a luminii ale eșantionului de nanoparticule de argint terminate cu citrat cu dimensiunea crescândă (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II și 50 nm: AgNP-III) sunt exprimate ca diametrul hidrodinamic mediu (media Z ) (dreapta) și potențialul zeta (stânga) se modifică în 24 de ore în diferite concentrații de NaCl.
Rezultatele UV-Vis din figura suplimentară S2 arată că SPR de 50 și 150 mM NaCl în toate cele trei probe are o scădere instantanee și semnificativă.Acest lucru poate fi explicat prin DLS, deoarece agregarea pe bază de NaCl are loc mai rapid decât experimentele dependente de pH, ceea ce se explică prin diferența mare dintre măsurătorile timpurii (0, 1,5 și 3 ore).În plus, creșterea concentrației de sare va crește și permisivitatea relativă a mediului experimental, ceea ce va avea un efect profund asupra rezonanței plasmonilor de suprafață.29
Efectul NaCl este rezumat în rândul din mijloc al figurii 4. În general, se poate concluziona că creșterea concentrației de clorură de sodiu are un efect similar cu creșterea acidității, deoarece ionii Na+ au tendința de a se coordona în jurul grupelor carboxilat, suprimarea AgNP-urilor cu potențial zeta negativ.În plus, NaCl 150 mM a produs agregate de dimensiunea micronului în toate cele trei probe, ceea ce indică faptul că concentrația fiziologică de electrolit este dăunătoare stabilității coloidale a AgNP-urilor terminate cu citrat.Luând în considerare concentrația critică de condensare (CCC) a NaCl pe sisteme AgNP similare, aceste rezultate pot fi plasate în mod inteligent în literatura relevantă.Huynh și colab.a calculat că CCC de NaCl pentru nanoparticulele de argint terminate cu citrat cu un diametru mediu de 71 nm a fost de 47,6 mM, în timp ce El Badawy și colab.a observat că CCC a AgNP-urilor de 10 nm cu acoperire cu citrat a fost de 70 mM.10,16 În plus, CCC semnificativ ridicat de aproximativ 300 mM a fost măsurat de He și colab., ceea ce a făcut ca metoda lor de sinteză să fie diferită de publicația menționată anterior.48 Deși contribuția actuală nu vizează o analiză cuprinzătoare a acestor valori, deoarece condițiile noastre experimentale cresc în complexitatea întregului studiu, concentrația de NaCl relevantă biologic de 50 mM, în special NaCl 150 mM, pare a fi destul de mare.Coagularea indusă, explicând modificările puternice detectate.
Următorul pas în experimentul de polimerizare este utilizarea moleculelor simple, dar relevante din punct de vedere biologic pentru a simula interacțiunile nanoparticule-biomoleculă.Pe baza rezultatelor DLS (Figurile 6 și 7) și UV-Vis (Figurile suplimentare S3 și S4), pot fi afirmate câteva concluzii generale.În condițiile noastre experimentale, moleculele studiate de glucoză și glutamina nu vor induce agregarea în niciun sistem AgNP, deoarece tendința Z-mean este strâns legată de valoarea de măsurare de referință corespunzătoare.Deși prezența lor nu afectează agregarea, rezultatele experimentale arată că aceste molecule sunt parțial adsorbite pe suprafața AgNP-urilor.Cel mai proeminent rezultat care susține această viziune este schimbarea observată în absorbția luminii.Deși AgNP-I nu prezintă modificări semnificative ale lungimii de undă sau intensității, poate fi observat mai clar prin măsurarea particulelor mai mari, ceea ce se datorează cel mai probabil sensibilității optice mai mari menționate mai devreme.Indiferent de concentrație, glucoza poate provoca o schimbare mai mare spre roșu după 1,5 ore în comparație cu măsurarea de control, care este de aproximativ 40 nm în AgNP-II și aproximativ 10 nm în AgNP-III, ceea ce demonstrează apariția interacțiunilor de suprafață.Glutamina a arătat o tendință similară, dar schimbarea nu a fost atât de evidentă.În plus, este de menționat și faptul că glutamina poate reduce potențialul zeta absolut al particulelor medii și mari.Cu toate acestea, deoarece aceste modificări zeta nu par să afecteze nivelul de agregare, se poate specula că chiar și biomoleculele mici precum glutamina pot oferi un anumit grad de repulsie spațială între particule.
Figura 6 Rezultatele împrăștierii dinamice a luminii ale probelor de nanoparticule de argint terminate cu citrat cu dimensiunea crescândă (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II și 50 nm: AgNP-III) sunt exprimate ca diametrul hidrodinamic mediu (media Z) (dreapta) În condiții externe de diferite concentrații de glucoză, potențialul zeta (stânga) se modifică în 24 de ore.
Figura 7 Rezultatele împrăștierii dinamice a luminii ale eșantionului de nanoparticule de argint terminate cu citrat cu dimensiunea crescândă (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II și 50 nm: AgNP-III) sunt exprimate ca diametrul hidrodinamic mediu (media Z ) (dreapta) În prezența glutaminei, potențialul zeta (stânga) se modifică în 24 de ore.
Pe scurt, biomoleculele mici precum glucoza și glutamina nu afectează stabilitatea coloidală la concentrația măsurată: deși afectează potențialul zeta și rezultatele UV-Vis în grade diferite, rezultatele medii Z nu sunt consecvente.Acest lucru indică faptul că adsorbția la suprafață a moleculelor inhibă repulsia electrostatică, dar în același timp oferă stabilitate dimensională.
Pentru a lega rezultatele anterioare cu rezultatele anterioare și a simula condițiile biologice mai abil, am selectat unele dintre cele mai frecvent utilizate componente ale culturii celulare și le-am folosit ca condiții experimentale pentru studiul stabilității coloizilor AgNP.În întregul experiment in vitro, una dintre cele mai importante funcții ale DMEM ca mediu este de a stabili condițiile osmotice necesare, dar din punct de vedere chimic, este o soluție complexă de sare cu o putere ionică totală similară cu 150 mM NaCl. .40 În ceea ce privește FBS, este un amestec complex de biomolecule - în principal proteine ​​- din punct de vedere al adsorbției la suprafață, are unele asemănări cu rezultatele experimentale ale glucozei și glutaminei, în ciuda compoziției chimice și a diversității Sexul este mult mai complicat.19 DLS și UV-Rezultatele vizibile prezentate în Figura 8 și, respectiv, în Figura suplimentară S5, pot fi explicate prin examinarea compoziției chimice a acestor materiale și corelarea acestora cu măsurătorile din secțiunea anterioară.
Figura 8 Rezultatele împrăștierii dinamice a luminii ale eșantionului de nanoparticule de argint terminate cu citrat cu dimensiunea crescândă (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II și 50 nm: AgNP-III) sunt exprimate ca diametrul hidrodinamic mediu (media Z ) (dreapta) În prezența componentelor culturii celulare DMEM și FBS, potențialul zeta (stânga) se modifică în 24 de ore.
Diluarea AgNP-urilor de diferite dimensiuni în DMEM are un efect similar asupra stabilității coloidale cu cel observat în prezența concentrațiilor mari de NaCl.Dispersia AgNP în 50 v/v% DMEM a arătat că agregarea la scară largă a fost detectată cu creșterea potențialului zeta și a valorii medii Z și scăderea bruscă a intensității SPR.Este de remarcat faptul că dimensiunea maximă a agregatului indusă de DMEM după 24 de ore este invers proporțională cu dimensiunea nanoparticulelor de primer.
Interacțiunea dintre FBS și AgNP este similară cu cea observată în prezența unor molecule mai mici precum glucoza și glutamina, dar efectul este mai puternic.Media Z a particulelor rămâne neafectată, în timp ce se detectează o creștere a potențialului zeta.Vârful SPR a arătat o ușoară deplasare la roșu, dar poate mai interesant, intensitatea SPR nu a scăzut la fel de semnificativ ca în măsurarea de control.Aceste rezultate pot fi explicate prin adsorbția înnăscută a macromoleculelor pe suprafața nanoparticulelor (rândul de jos din Figura 4), care este acum înțeleasă ca formarea coroanei biomoleculare în organism.49