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Le nanoparticelle più piccole sono sempre migliori?Comprendere gli effetti biologici dell'aggregazione dipendente dalle dimensioni delle nanoparticelle d'argento in condizioni biologicamente rilevanti
Autori: Bélteky P, Rónavári A, Zakupszky D, Boka E, Igaz N, Szerencsés B, Pfeiffer I, Vágvölgyi C, Kiricsi M, Kónya Z
Péter Bélteky,1,* Andrea Rónavári,1,* Dalma Zakupszky,1 Eszter Boka,1 Nóra Igaz,2 Bettina Szerencsés,3 Ilona Pfeiffer,3 Csaba Vágvölgyi,3 Mónika Kiricsi di Chimica Ambientale, Ungheria, Facoltà di Scienze e Informatica di Ungheria , Università di Szeged;2 Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare, Facoltà di Scienze e Informazione, Università di Szeged, Ungheria;3 Dipartimento di Microbiologia, Facoltà di Scienze e Informazione, Università di Szeged, Ungheria;4MTA-SZTE Gruppo di ricerca sulla cinetica di reazione e sulla chimica delle superfici, Szeged, Ungheria* Questi autori hanno contribuito in egual misura a questo lavoro.Comunicazione: Zoltán Kónya Dipartimento di Chimica Applicata e Ambientale, Facoltà di Scienze e Informatica, Università di Szeged, Piazza Rerrich 1, Szeged, H-6720, Ungheria Telefono +36 62 544620 E-mail [Protezione e-mail] Scopo: Le nanoparticelle d'argento (AgNP) sono uno dei nanomateriali più comunemente studiati, soprattutto per le loro applicazioni biomediche.Tuttavia, a causa dell’aggregazione delle nanoparticelle, la loro eccellente citotossicità e attività antibatterica sono spesso compromesse nei mezzi biologici.In questo lavoro sono stati studiati il ​​comportamento di aggregazione e le relative attività biologiche di tre diversi campioni di nanoparticelle d'argento con terminazione citrato con un diametro medio di 10, 20 e 50 nm.Metodo: utilizzare il microscopio elettronico a trasmissione per sintetizzare e caratterizzare le nanoparticelle, valutare il loro comportamento di aggregazione a vari valori di pH, concentrazioni di NaCl, glucosio e glutammina mediante diffusione dinamica della luce e spettroscopia ultravioletta-visibile.Inoltre, nel terreno di coltura cellulare componenti come Dulbecco migliorano il comportamento di aggregazione in Eagle Medium e Fetal Calf Serum.Risultati: I risultati mostrano che il pH acido e il contenuto fisiologico di elettroliti generalmente inducono un'aggregazione su scala micron, che può essere mediata dalla formazione della corona biomolecolare.Vale la pena notare che le particelle più grandi mostrano una maggiore resistenza alle influenze esterne rispetto alle loro controparti più piccole.Sono stati eseguiti test di citotossicità e antibatterici in vitro trattando le cellule con aggregati di nanoparticelle a diversi stadi di aggregazione.Conclusione: i nostri risultati rivelano una profonda correlazione tra stabilità colloidale e tossicità degli AgNP, poiché l'aggregazione estrema porta alla completa perdita di attività biologica.Il grado più elevato di antiaggregazione osservato per le particelle più grandi ha un impatto significativo sulla tossicità in vitro, poiché tali campioni conservano una maggiore attività antimicrobica e cellulare di mammifero.Questi risultati portano alla conclusione che, nonostante l’opinione generale nella letteratura pertinente, prendere di mira le nanoparticelle più piccole possibili potrebbe non essere la migliore linea d’azione.Parole chiave: crescita mediata dai semi, stabilità colloidale, comportamento di aggregazione dipendente dalle dimensioni, tossicità da danno da aggregazione
Poiché la domanda e la produzione di nanomateriali continuano ad aumentare, viene prestata sempre più attenzione alla loro biosicurezza o attività biologica.Le nanoparticelle d'argento (AgNP) sono uno dei rappresentanti di questa classe di materiali più comunemente sintetizzati, ricercati e utilizzati grazie alle loro eccellenti proprietà catalitiche, ottiche e biologiche.1 Si ritiene generalmente che le caratteristiche uniche dei nanomateriali (compresi gli AgNP) siano principalmente attribuite alla loro ampia superficie specifica.Pertanto, l'inevitabile problema è che qualsiasi processo che influenzi questa caratteristica chiave, come la dimensione delle particelle, il rivestimento superficiale o l'aggregazione, danneggerà gravemente le proprietà delle nanoparticelle che sono fondamentali per applicazioni specifiche.
Gli effetti della dimensione delle particelle e degli stabilizzanti sono argomenti relativamente ben documentati in letteratura.Ad esempio, l’opinione generalmente accettata è che le nanoparticelle più piccole siano più tossiche delle nanoparticelle più grandi.2 Coerentemente con la letteratura generale, i nostri studi precedenti hanno dimostrato l'attività dipendente dalle dimensioni del nanoargento su cellule e microrganismi di mammiferi.3– 5 Il rivestimento superficiale è un'altra caratteristica che ha un'ampia influenza sulle proprietà dei nanomateriali.Semplicemente aggiungendo o modificando stabilizzanti sulla sua superficie, lo stesso nanomateriale può avere proprietà fisiche, chimiche e biologiche completamente diverse.L'applicazione degli agenti di copertura viene spesso eseguita come parte della sintesi delle nanoparticelle.Ad esempio, le nanoparticelle d'argento con terminazione citrato sono uno degli AgNP più rilevanti nella ricerca, che vengono sintetizzate riducendo i sali d'argento in una soluzione stabilizzante selezionata come mezzo di reazione.6 Il citrato può facilmente trarre vantaggio dal suo basso costo, disponibilità, biocompatibilità e forte affinità per l'argento, che può riflettersi in varie interazioni proposte, dall'adsorbimento superficiale reversibile alle interazioni ioniche.Anche piccole molecole e ioni poliatomici vicini a 7,8, come citrati, polimeri, polielettroliti e agenti biologici sono comunemente usati per stabilizzare il nano-argento ed eseguire su di esso funzionalizzazioni uniche.9-12
Sebbene la possibilità di alterare l’attività delle nanoparticelle mediante incappucciamento intenzionale della superficie sia un’area molto interessante, il ruolo principale di questo rivestimento superficiale è trascurabile, poiché fornisce stabilità colloidale al sistema di nanoparticelle.L’ampia superficie specifica dei nanomateriali produrrà una grande energia superficiale, che ostacola la capacità termodinamica del sistema di raggiungere la sua energia minima.13 Senza un’adeguata stabilizzazione ciò può portare all’agglomerazione di nanomateriali.L'aggregazione è la formazione di aggregati di particelle di varie forme e dimensioni che avviene quando le particelle disperse si incontrano e le attuali interazioni termodinamiche consentono alle particelle di aderire tra loro.Pertanto, gli stabilizzanti vengono utilizzati per prevenire l'aggregazione introducendo una forza repulsiva sufficientemente grande tra le particelle per contrastare la loro attrazione termodinamica.14
Sebbene il tema della dimensione delle particelle e della copertura superficiale sia stato esplorato a fondo nel contesto della regolazione delle attività biologiche innescate dalle nanoparticelle, l’aggregazione delle particelle è un’area ampiamente trascurata.Non esiste quasi nessuno studio approfondito per risolvere la stabilità colloidale delle nanoparticelle in condizioni biologicamente rilevanti.10,15-17 Inoltre, questo contributo è particolarmente raro, dove è stata studiata anche la tossicità associata all'aggregazione, anche se può causare reazioni avverse, come trombosi vascolare, o perdita di caratteristiche desiderate, come la sua tossicità, come mostrato nella Figura 1.18, 19 mostrato.In effetti, uno dei pochi meccanismi conosciuti di resistenza alle nanoparticelle d'argento è legato all'aggregazione, perché è stato riportato che alcuni ceppi di E. coli e Pseudomonas aeruginosa riducono la loro sensibilità alle nanoparticelle d'argento esprimendo la proteina flagellina, flagellina.Ha un'elevata affinità per l'argento, inducendone così l'aggregazione.20
Esistono diversi meccanismi legati alla tossicità delle nanoparticelle d’argento e l’aggregazione influisce su tutti questi meccanismi.Il metodo più discusso dell’attività biologica delle AgNP, a volte indicato come il meccanismo del “cavallo di Troia”, considera le AgNP come portatori di Ag+.1,21 Il meccanismo del cavallo di Troia può garantire un notevole aumento della concentrazione locale di Ag+, che porta alla generazione di ROS e alla depolarizzazione della membrana.22-24 L'aggregazione può influenzare il rilascio di Ag+, influenzando così la tossicità, perché riduce la superficie attiva effettiva dove gli ioni argento possono essere ossidati e disciolti.Tuttavia, gli AgNP non mostreranno tossicità solo attraverso il rilascio di ioni.È necessario considerare molte interazioni legate alle dimensioni e alla morfologia.Tra questi, le dimensioni e la forma della superficie delle nanoparticelle sono le caratteristiche distintive.4,25 L’insieme di questi meccanismi può essere classificato come “meccanismi di tossicità indotta”.Esistono potenzialmente molte reazioni mitocondriali e di membrana superficiale che possono danneggiare gli organelli e causare la morte cellulare.25-27 Poiché la formazione degli aggregati influenza naturalmente la dimensione e la forma degli oggetti contenenti argento riconosciuti dai sistemi viventi, anche queste interazioni possono essere influenzate.
Nel nostro precedente articolo sull’aggregazione delle nanoparticelle d’argento, abbiamo dimostrato un’efficace procedura di screening composta da esperimenti chimici e biologici in vitro per studiare questo problema.19 La diffusione dinamica della luce (DLS) è la tecnica preferita per questi tipi di ispezioni perché il materiale può diffondere fotoni a una lunghezza d'onda paragonabile alla dimensione delle sue particelle.Poiché la velocità di movimento browniano delle particelle nel mezzo liquido è correlata alla dimensione, la variazione dell'intensità della luce diffusa può essere utilizzata per determinare il diametro idrodinamico medio (media Z) del campione liquido.28 Inoltre, applicando una tensione al campione, il potenziale zeta (potenziale ζ) della nanoparticella può essere misurato in modo simile al valore medio Z.13,28 Se il valore assoluto del potenziale zeta è sufficientemente elevato (secondo le linee guida generali> ±30 mV), genererà una forte repulsione elettrostatica tra le particelle per contrastare l'aggregazione.La risonanza plasmonica di superficie caratteristica (SPR) è un fenomeno ottico unico, attribuito principalmente a nanoparticelle di metalli preziosi (principalmente Au e Ag).29​​ Sulla base delle oscillazioni elettroniche (plasmoni superficiali) di questi materiali su scala nanometrica, è noto che gli AgNP sferici hanno un caratteristico picco di assorbimento UV-Vis vicino a 400 nm.30 L'intensità e lo spostamento della lunghezza d'onda delle particelle vengono utilizzati per integrare i risultati DLS, poiché questo metodo può essere utilizzato per rilevare l'aggregazione delle nanoparticelle e l'adsorbimento superficiale delle biomolecole.
Sulla base delle informazioni ottenute, i test di vitalità cellulare (MTT) e antibatterici vengono eseguiti in modo tale che la tossicità dell'AgNP sia descritta come una funzione del livello di aggregazione, piuttosto che (il fattore più comunemente utilizzato) della concentrazione di nanoparticelle.Questo metodo unico ci consente di dimostrare la profonda importanza del livello di aggregazione nell'attività biologica, perché, ad esempio, gli AgNP citrato-terminati perdono completamente la loro attività biologica entro poche ore a causa dell'aggregazione.19
Nel lavoro attuale, miriamo ad espandere notevolmente i nostri precedenti contributi sulla stabilità dei colloidi biocorrelati e sul loro impatto sull'attività biologica studiando l'effetto della dimensione delle nanoparticelle sull'aggregazione delle nanoparticelle.Questo è senza dubbio uno degli studi sulle nanoparticelle.Una prospettiva di profilo più elevato e 31 Per studiare questo problema, è stato utilizzato un metodo di crescita mediata dai semi per produrre AgNP con terminazione citrato in tre diversi intervalli di dimensioni (10, 20 e 50 nm).6,32 come uno dei metodi più comuni.Per i nanomateriali che sono ampiamente e abitualmente utilizzati nelle applicazioni mediche, vengono selezionati AgNP citrato-terminati di diverse dimensioni per studiare la possibile dipendenza dalle dimensioni delle proprietà biologiche del nanoargento legate all'aggregazione.Dopo aver sintetizzato AgNP di diverse dimensioni, abbiamo caratterizzato i campioni prodotti mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e quindi abbiamo esaminato le particelle utilizzando la procedura di screening sopra menzionata.Inoltre, in presenza di colture cellulari in vitro di Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) e Fetal Bovine Serum (FBS), il comportamento di aggregazione dipendente dalle dimensioni e il suo comportamento sono stati valutati a vari valori di pH, NaCl, glucosio e concentrazioni di glutammina.Le caratteristiche della citotossicità sono determinate in condizioni complete.Il consenso scientifico indica che in generale sono preferibili particelle più piccole;la nostra indagine fornisce una piattaforma chimica e biologica per determinare se questo è il caso.
Tre nanoparticelle d'argento con diversi intervalli di dimensioni sono state preparate mediante il metodo di crescita mediata dai semi proposto da Wan et al., con lievi aggiustamenti.6 Questo metodo si basa sulla riduzione chimica, utilizzando il nitrato d'argento (AgNO3) come fonte d'argento, il boroidruro di sodio (NaBH4) come agente riducente e il citrato di sodio come stabilizzante.Innanzitutto, preparare 75 mL di soluzione acquosa di citrato 9 mM da citrato di sodio diidrato (Na3C6H5O7 x 2H2O) e riscaldare a 70°C.Quindi, 2 mL di soluzione AgNO3 all'1% p/v sono stati aggiunti al mezzo di reazione, e quindi la soluzione di boroidruro di sodio appena preparata (2 mL 0,1% p/v) è stata versata goccia a goccia nella miscela.La sospensione giallo-marrone risultante è stata mantenuta a 70°C con vigorosa agitazione per 1 ora, e quindi raffreddata a temperatura ambiente.Il campione risultante (da ora in poi denominato AgNP-I) viene utilizzato come base per la crescita mediata dai semi nella successiva fase di sintesi.
Per sintetizzare una sospensione di particelle di medie dimensioni (indicata come AgNP-II), riscaldare 90 ml di soluzione di citrato 7,6 mM a 80°C, mescolarla con 10 ml di AgNP-I, quindi mescolare 2 ml di soluzione AgNO3 all'1% p/v è stato mantenuto sotto vigorosa agitazione meccanica per 1 ora, quindi il campione è stato raffreddato a temperatura ambiente.
Per la particella più grande (AgNP-III), ripetere lo stesso processo di crescita, ma in questo caso utilizzare 10 mL di AgNP-II come sospensione del seme.Dopo che i campioni hanno raggiunto la temperatura ambiente, impostano la concentrazione nominale di Ag in base al contenuto totale di AgNO3 su 150 ppm aggiungendo o facendo evaporare ulteriore solvente a 40°C e infine conservandoli a 4°C fino a ulteriore utilizzo.
Utilizzare il microscopio elettronico a trasmissione FEI Tecnai G2 20 X-Twin (TEM) (sede centrale FEI, Hillsboro, Oregon, USA) con una tensione di accelerazione di 200 kV per esaminare le caratteristiche morfologiche delle nanoparticelle e catturare il loro modello di diffrazione elettronica (ED).Almeno 15 immagini rappresentative (~750 particelle) sono state valutate utilizzando il pacchetto software ImageJ e gli istogrammi risultanti (e tutti i grafici dell'intero studio) sono stati creati in OriginPro 2018 (OriginLab, Northampton, MA, USA) 33, 34.
Sono stati misurati il ​​diametro idrodinamico medio (media Z), il potenziale zeta (potenziale ζ) e la risonanza plasmonica superficiale caratteristica (SPR) dei campioni per illustrare le loro proprietà colloidali iniziali.Il diametro idrodinamico medio e il potenziale zeta del campione sono stati misurati con lo strumento Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, Regno Unito) utilizzando cellule capillari piegate usa e getta a 37±0,1°C.Lo spettrofotometro UV-Vis Ocean Optics 355 DH-2000-BAL (Halma PLC, Largo, FL, USA) è stato utilizzato per ottenere le caratteristiche SPR caratteristiche dagli spettri di assorbimento UV-Vis dei campioni nell'intervallo 250-800 nm.
Durante l'intero esperimento sono stati effettuati contemporaneamente tre diversi tipi di misurazioni relative alla stabilità colloidale.Utilizzare DLS per misurare il diametro idrodinamico medio (media Z) e il potenziale zeta (potenziale ζ) delle particelle, poiché la media Z è correlata alla dimensione media degli aggregati di nanoparticelle e il potenziale zeta indica se la repulsione elettrostatica nel sistema è abbastanza forte da compensare l'attrazione di Van der Waals tra le nanoparticelle.Le misurazioni vengono effettuate in triplicato e la deviazione standard della media Z e del potenziale zeta viene calcolata dal software Zetasizer.Gli spettri SPR caratteristici delle particelle vengono valutati mediante spettroscopia UV-Vis, poiché i cambiamenti nell'intensità di picco e nella lunghezza d'onda possono indicare aggregazione e interazioni superficiali.29,35 In effetti, la risonanza plasmonica superficiale nei metalli preziosi è così influente che ha portato a nuovi metodi di analisi delle biomolecole.29,36,37 La concentrazione di AgNP nella miscela sperimentale è di circa 10 ppm e lo scopo è impostare l'intensità dell'assorbimento SPR iniziale massimo su 1. L'esperimento è stato condotto in modo dipendente dal tempo a 0;1,5;3;6;12 e 24 ore in varie condizioni biologicamente rilevanti.Maggiori dettagli che descrivono l'esperimento possono essere visti nel nostro lavoro precedente.19 In breve, diversi valori di pH (3; 5; 7,2 e 9), diverse concentrazioni di cloruro di sodio (10 mM; 50 mM; 150 mM), glucosio (3,9 mM; 6,7 mM) e glutammina (4 mM), e hanno anche preparato il Medium Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) e il siero bovino fetale (FBS) (in acqua e DMEM) come sistemi modello e hanno studiato i loro effetti sul comportamento di aggregazione delle nanoparticelle d'argento sintetizzate.pH I valori di NaCl, glucosio e glutammina vengono valutati in base alle concentrazioni fisiologiche, mentre le quantità di DMEM e FBS sono le stesse dei livelli utilizzati nell'intero esperimento in vitro.38-42 Tutte le misurazioni sono state eseguite a pH 7,2 e 37°C con una concentrazione salina di fondo costante di 10 mM NaCl per eliminare qualsiasi interazione delle particelle a lunga distanza (ad eccezione di alcuni esperimenti relativi a pH e NaCl, dove questi attributi sono le variabili sotto studio).28 L'elenco delle varie condizioni è riassunto nella Tabella 1. L'esperimento contrassegnato con † viene utilizzato come riferimento e corrisponde a un campione contenente 10 mM NaCl e pH 7,2.
La linea cellulare di cancro alla prostata umana (DU145) e i cheratinociti umani immortalizzati (HaCaT) sono stati ottenuti da ATCC (Manassas, VA, USA).Le cellule vengono regolarmente coltivate nel mezzo minimo essenziale Eagle (DMEM) di Dulbecco contenente 4,5 g/L di glucosio (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), integrato con FBS al 10%, L-glutammina 2 mM, streptomicina allo 0,01% e streptomicina allo 0,005%. Penicillina (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA).Le cellule vengono coltivate in un incubatore a 37°C sotto il 5% di CO2 e il 95% di umidità.
Per esplorare i cambiamenti nella citotossicità dell'AgNP causati dall'aggregazione delle particelle in modo dipendente dal tempo, è stato eseguito un test MTT in due fasi.Innanzitutto, la vitalità dei due tipi cellulari è stata misurata dopo il trattamento con AgNP-I, AgNP-II e AgNP-III.A tal fine, i due tipi di cellule sono stati seminati in piastre da 96 pozzetti con una densità di 10.000 cellule/pozzetto e trattati con tre diverse dimensioni di nanoparticelle d'argento in concentrazioni crescenti il ​​secondo giorno.Dopo 24 ore di trattamento, le cellule sono state lavate con PBS e incubate con 0,5 mg/mL di reagente MTT (SERVA, Heidelberg, Germania) diluito in terreno di coltura per 1 ora a 37°C.I cristalli di formazano sono stati sciolti in DMSO (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) e l'assorbimento è stato misurato a 570 nm utilizzando un lettore di piastre Synergy HTX (BioTek-Ungheria, Budapest, Ungheria).Il valore di assorbimento del campione di controllo non trattato è considerato un tasso di sopravvivenza del 100%.Eseguire almeno 3 esperimenti utilizzando quattro repliche biologiche indipendenti.L'IC50 viene calcolata da una curva dose-risposta basata sui risultati di vitalità.
Successivamente, nella seconda fase, incubando le particelle con NaCl 150 mM per diversi periodi di tempo (0, 1,5, 3, 6, 12 e 24 ore) prima del trattamento cellulare, sono stati prodotti diversi stati di aggregazione delle nanoparticelle d'argento.Successivamente, è stato eseguito lo stesso test MTT descritto in precedenza per valutare i cambiamenti nella vitalità cellulare influenzati dall'aggregazione delle particelle.Utilizzare GraphPad Prism 7 per valutare il risultato finale, calcolare la significatività statistica dell'esperimento mediante t-test non accoppiato e contrassegnare il suo livello come * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01), *** (p ≤ 0,001 ) E **** (p ≤ 0,0001).
Tre diverse dimensioni di nanoparticelle d'argento (AgNP-I, AgNP-II e AgNP-III) sono state utilizzate per la sensibilità antibatterica a Cryptococcus neoformans IFM 5844 (IFM; Centro di ricerca per funghi patogeni e tossicologia microbica, Università di Chiba) e Bacillus Test megaterium SZMC 6031 (SZMC: Szeged Microbiology Collection) ed E. coli SZMC 0582 in terreno RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Co.).Per valutare i cambiamenti nell'attività antibatterica causati dall'aggregazione delle particelle, in primo luogo, la loro concentrazione minima inibente (MIC) è stata determinata mediante microdiluizione in una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti.A 50 μL di sospensione cellulare standardizzata (5 × 104 cellule/mL in mezzo RPMI 1640), aggiungere 50 μL di sospensione di nanoparticelle d'argento e diluire in serie due volte la concentrazione (nel suddetto mezzo, l'intervallo è compreso tra 0 e 75 ppm, cioè il campione di controllo contiene 50 μL di sospensione cellulare e 50 μL di terreno senza nanoparticelle).Successivamente, la piastra è stata incubata a 30°C per 48 ore e la densità ottica della coltura è stata misurata a 620 nm utilizzando un lettore di piastre SPECTROstar Nano (BMG LabTech, Offenburg, Germania).L'esperimento è stato eseguito tre volte in triplicato.
Tranne che in questo momento sono stati utilizzati 50 μL di singoli campioni di nanoparticelle aggregate, la stessa procedura descritta in precedenza è stata utilizzata per esaminare l'effetto dell'aggregazione sull'attività antibatterica sui ceppi sopra menzionati.Diversi stati di aggregazione delle nanoparticelle d'argento vengono prodotti incubando le particelle con NaCl 150 mM per diversi periodi di tempo (0, 1,5, 3, 6, 12 e 24 ore) prima dell'elaborazione cellulare.Come controllo della crescita è stata utilizzata una sospensione addizionata con 50 μL di terreno RPMI 1640, mentre per controllare la tossicità è stata utilizzata una sospensione con nanoparticelle non aggregate.L'esperimento è stato eseguito tre volte in triplicato.Utilizza GraphPad Prism 7 per valutare nuovamente il risultato finale, utilizzando la stessa analisi statistica dell'analisi MTT.
Il livello di aggregazione delle particelle più piccole (AgNP-I) è stato caratterizzato e i risultati sono stati parzialmente pubblicati nel nostro lavoro precedente, ma per un confronto migliore, tutte le particelle sono state accuratamente vagliate.I dati sperimentali sono raccolti e discussi nelle sezioni seguenti.Tre dimensioni di AgNP.19
Le misurazioni eseguite da TEM, UV-Vis e DLS hanno verificato la corretta sintesi di tutti i campioni AgNP (Figura 2A-D).Secondo la prima riga della Figura 2, la particella più piccola (AgNP-I) mostra una morfologia sferica uniforme con un diametro medio di circa 10 nm.Il metodo di crescita mediata dai semi fornisce inoltre AgNP-II e AgNP-III con intervalli di dimensioni diverse con diametri medi delle particelle di circa 20 nm e 50 nm, rispettivamente.Secondo la deviazione standard della distribuzione delle particelle, le dimensioni dei tre campioni non si sovrappongono, il che è importante per la loro analisi comparativa.Confrontando le proporzioni medie e il rapporto di sottigliezza delle proiezioni 2D di particelle basate su TEM, si presuppone che la sfericità delle particelle venga valutata dal plug-in del filtro forma di ImageJ (Figura 2E).43 Secondo l'analisi della forma delle particelle, il loro rapporto d'aspetto (lato grande/lato corto del rettangolo di delimitazione più piccolo) non è influenzato dalla crescita delle particelle, e il loro rapporto di sottigliezza (area misurata del corrispondente cerchio perfetto/area teorica ) diminuisce gradualmente.Ciò si traduce in un numero sempre maggiore di particelle poliedriche, che in teoria sono perfettamente rotonde, corrispondenti a un rapporto di sottigliezza pari a 1.
Figura 2 Immagine al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) (A), modello di diffrazione elettronica (ED) (B), istogramma di distribuzione dimensionale (C), spettro caratteristico di assorbimento della luce ultravioletto-visibile (UV-Vis) (D) e citrato fluido medio Le nanoparticelle d'argento terminate con diametro meccanico (media Z), potenziale zeta, proporzioni e rapporto di spessore (E) hanno tre diversi intervalli di dimensioni: AgNP-I è 10 nm (riga superiore), AgNP -II è 20 nm (riga centrale ), AgNP-III (riga inferiore) è 50 nm.
Sebbene la natura ciclica del metodo di crescita abbia influenzato in una certa misura la forma delle particelle, determinando una sfericità minore degli AgNP più grandi, tutti e tre i campioni sono rimasti quasi sferici.Inoltre, come mostrato nel modello di diffrazione elettronica nella Figura 2B, la nano cristallinità delle particelle non viene influenzata.Il prominente anello di diffrazione, che può essere correlato con gli indici Miller dell'argento (111), (220), (200) e (311), è molto coerente con la letteratura scientifica e i nostri contributi precedenti.9, 19,44 La frammentazione dell'anello Debye-Scherrer di AgNP-II e AgNP-III è dovuta al fatto che l'immagine ED viene catturata allo stesso ingrandimento, quindi all'aumentare della dimensione delle particelle, il numero di particelle diffratte per l'area unitaria aumenta e diminuisce.
È noto che le dimensioni e la forma delle nanoparticelle influenzano l’attività biologica.3,45 L'attività catalitica e biologica dipendente dalla forma può essere spiegata dal fatto che forme diverse tendono a proliferare su determinate facce cristalline (aventi indici Miller diversi), e queste facce cristalline hanno attività diverse.45,46 Poiché le particelle preparate forniscono risultati ED simili corrispondenti a caratteristiche cristalline molto simili, si può presumere che nei nostri successivi esperimenti di stabilità colloidale e attività biologica, qualsiasi differenza osservata dovrebbe essere attribuita alla dimensione delle nanoparticelle, non alle proprietà legate alla forma.
I risultati UV-Vis riepilogati nella Figura 2D sottolineano ulteriormente la schiacciante natura sferica dell'AgNP sintetizzato, poiché i picchi SPR di tutti e tre i campioni sono intorno a 400 nm, che è un valore caratteristico delle nanoparticelle d'argento sferiche.29,30 Gli spettri catturati hanno inoltre confermato il successo della crescita del nanoargento mediata dai semi.All'aumentare della dimensione delle particelle, la lunghezza d'onda corrispondente al massimo assorbimento della luce dell'AgNP-II, in modo più prominente, secondo la letteratura, AgNP-III ha subito uno spostamento verso il rosso.6,29
Per quanto riguarda la stabilità colloidale iniziale del sistema AgNP, DLS è stato utilizzato per misurare il diametro idrodinamico medio e il potenziale zeta delle particelle a pH 7,2.I risultati illustrati nella Figura 2E mostrano che AgNP-III ha una stabilità colloidale maggiore rispetto ad AgNP-I o AgNP-II, poiché le linee guida comuni indicano che un potenziale zeta di 30 mV assoluto è necessario per la stabilità colloidale a lungo termine. Questa scoperta è ulteriormente supportata quando il valore medio Z (ottenuto come diametro idrodinamico medio delle particelle libere e aggregate) viene confrontato con la granulometria primaria ottenuta al TEM, perché quanto più vicini sono i due valori tanto più blando è il grado di raccolta nel campione.In effetti, la media Z di AgNP-I e AgNP-II è ragionevolmente superiore alla dimensione delle particelle principali valutate al TEM, quindi rispetto ad AgNP-III, si prevede che questi campioni abbiano maggiori probabilità di aggregarsi, dove il potenziale zeta altamente negativo è accompagnato da una dimensione vicina al valore medio Z.
La spiegazione di questo fenomeno può essere duplice.Da un lato, la concentrazione di citrato viene mantenuta a un livello simile in tutte le fasi della sintesi, fornendo una quantità relativamente elevata di gruppi superficiali carichi per evitare che l'area superficiale specifica delle particelle in crescita diminuisca.Tuttavia, secondo Levak et al., piccole molecole come il citrato possono essere facilmente scambiate dalle biomolecole sulla superficie delle nanoparticelle.In questo caso la stabilità colloidale sarà determinata dalla corona delle biomolecole prodotte.31 Poiché questo comportamento è stato osservato anche nelle nostre misurazioni di aggregazione (discusse più dettagliatamente in seguito), il limite massimo del citrato da solo non può spiegare questo fenomeno.
D'altra parte, la dimensione delle particelle è inversamente proporzionale alla tendenza all'aggregazione a livello nanometrico.Ciò è supportato principalmente dal tradizionale metodo Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO), in cui l'attrazione delle particelle è descritta come la somma delle forze attrattive e repulsive tra le particelle.Secondo He et al., il valore massimo della curva energetica DLVO diminuisce con la dimensione delle nanoparticelle nelle nanoparticelle di ematite, rendendo più facile il raggiungimento dell'energia primaria minima, favorendo così l'aggregazione irreversibile (condensazione).47 Tuttavia, si ipotizza che ci siano altri aspetti oltre i limiti della teoria DLVO.Sebbene la gravità di van der Waals e la repulsione elettrostatica del doppio strato siano simili all'aumentare della dimensione delle particelle, una revisione di Hotze et al.propone che abbia un effetto più forte sull'aggregazione di quanto consentito dal DLVO.14 Essi ritengono che la curvatura superficiale delle nanoparticelle non possa più essere stimata come una superficie piana, rendendo inapplicabile la stima matematica.Inoltre, man mano che la dimensione delle particelle diminuisce, la percentuale di atomi presenti sulla superficie aumenta, portando alla struttura elettronica e al comportamento della carica superficiale.E cambia la reattività superficiale, che può portare ad una diminuzione della carica nel doppio strato elettrico e favorire l'aggregazione.
Confrontando i risultati DLS di AgNP-I, AgNP-II e AgNP-III nella Figura 3, abbiamo osservato che tutti e tre i campioni mostravano un pH simile che induceva l'aggregazione.Un ambiente fortemente acido (pH 3) sposta il potenziale zeta del campione a 0 mV, facendo sì che le particelle formino aggregati di dimensioni micron, mentre il pH alcalino sposta il suo potenziale zeta verso un valore negativo maggiore, dove le particelle formano aggregati più piccoli (pH 5 ).E 7.2) ), oppure rimangono completamente non aggregati (pH 9).Sono state inoltre osservate alcune importanti differenze tra i diversi campioni.Nel corso dell'esperimento, AgNP-I si è dimostrato il più sensibile ai cambiamenti di potenziale zeta indotti dal pH, poiché il potenziale zeta di queste particelle è stato ridotto a pH 7,2 rispetto a pH 9, mentre AgNP-II e AgNP-III hanno mostrato solo A un cambiamento considerevole in ζ è intorno a pH 3. Inoltre, AgNP-II ha mostrato cambiamenti più lenti e un potenziale zeta moderato, mentre AgNP-III ha mostrato il comportamento più blando dei tre, perché il sistema ha mostrato il valore zeta assoluto più alto e un movimento di tendenza lento, indicando AgNP-III Il più resistente all'aggregazione indotta dal pH.Questi risultati sono coerenti con i risultati della misurazione del diametro idrodinamico medio.Considerando la dimensione delle particelle dei loro primer, AgNP-I ha mostrato un'aggregazione graduale e costante a tutti i valori di pH, molto probabilmente a causa del fondo di NaCl da 10 mM, mentre AgNP-II e AgNP-III hanno mostrato un'aggregazione significativa solo a pH 3 di raccolta.La differenza più interessante è che, nonostante le sue grandi dimensioni delle nanoparticelle, AgNP-III forma gli aggregati più piccoli a pH 3 in 24 ore, evidenziando le sue proprietà antiaggreganti.Dividendo la Z media degli AgNP a pH 3 dopo 24 ore per il valore del campione preparato, si può osservare che le dimensioni relative degli aggregati di AgNP-I e AgNP-II sono aumentate di 50 volte, 42 volte e 22 volte , rispettivamente.III.
Figura 3 I risultati della diffusione dinamica della luce del campione di nanoparticelle d'argento con terminazione citrato di dimensioni crescenti (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II e 50 nm: AgNP-III) sono espressi come diametro idrodinamico medio (Z media ) (a destra) In diverse condizioni di pH, il potenziale zeta (a sinistra) cambia entro 24 ore.
L'aggregazione pH-dipendente osservata ha influenzato anche la caratteristica risonanza plasmonica superficiale (SPR) dei campioni AgNP, come evidenziato dai loro spettri UV-Vis.Secondo la Figura supplementare S1, l'aggregazione di tutte e tre le sospensioni di nanoparticelle d'argento è seguita da una riduzione dell'intensità dei loro picchi SPR e da un moderato spostamento verso il rosso.L'entità di questi cambiamenti in funzione del pH è coerente con il grado di aggregazione previsto dai risultati DLS, tuttavia sono state osservate alcune tendenze interessanti.Contrariamente all'intuizione, risulta che l'AgNP-II di medie dimensioni è il più sensibile ai cambiamenti dell'SPR, mentre gli altri due campioni sono meno sensibili.Nella ricerca SPR, 50 nm è il limite teorico delle dimensioni delle particelle, utilizzato per distinguere le particelle in base alle loro proprietà dielettriche.Le particelle più piccole di 50 nm (AgNP-I e AgNP-II) possono essere descritte come semplici dipoli dielettrici, mentre le particelle che raggiungono o superano questo limite (AgNP-III) hanno proprietà dielettriche più complesse e la loro risonanza La banda si divide in cambiamenti multimodali .Nel caso di due campioni di particelle più piccole, gli AgNP possono essere considerati semplici dipoli e il plasma può facilmente sovrapporsi.All’aumentare della dimensione delle particelle, questo accoppiamento produce essenzialmente un plasma più grande, il che potrebbe spiegare la maggiore sensibilità osservata.29 Tuttavia, per le particelle più grandi, la semplice stima del dipolo non è valida quando possono verificarsi anche altri stati di accoppiamento, il che può spiegare la diminuzione della tendenza dell'AgNP-III a indicare cambiamenti spettrali.29
Nelle nostre condizioni sperimentali, è dimostrato che il valore del pH ha un profondo effetto sulla stabilità colloidale delle nanoparticelle d'argento rivestite con citrato di varie dimensioni.In questi sistemi, la stabilità è fornita dai gruppi -COO- caricati negativamente sulla superficie degli AgNP.Il gruppo funzionale carbossilato dello ione citrato è protonato in un gran numero di ioni H+, quindi il gruppo carbossilico generato non può più fornire repulsione elettrostatica tra le particelle, come mostrato nella riga superiore della Figura 4. Secondo il principio di Le Chatelier, AgNP i campioni si aggregano rapidamente a pH 3, ma diventano gradualmente sempre più stabili all’aumentare del pH.
Figura 4 Meccanismo schematico dell'interazione superficiale definito dall'aggregazione a diversi pH (riga superiore), concentrazione di NaCl (riga centrale) e biomolecole (riga inferiore).
Secondo la Figura 5, la stabilità colloidale nelle sospensioni AgNP di diverse dimensioni è stata esaminata anche con concentrazioni saline crescenti.Sulla base del potenziale zeta, l'aumento delle dimensioni delle nanoparticelle in questi sistemi AgNP citrato-terminati fornisce nuovamente una maggiore resistenza alle influenze esterne di NaCl.In AgNP-I, 10 mM di NaCl sono sufficienti per indurre una lieve aggregazione e una concentrazione salina di 50 mM fornisce risultati molto simili.In AgNP-II e AgNP-III, 10 mM di NaCl non influenzano significativamente il potenziale zeta perché i loro valori rimangono a (AgNP-II) o inferiori (AgNP-III) a -30 mV.Aumentare la concentrazione di NaCl a 50 mM e infine a 150 mM NaCl è sufficiente per ridurre significativamente il valore assoluto del potenziale zeta in tutti i campioni, sebbene le particelle più grandi mantengano una maggiore carica negativa.Questi risultati sono coerenti con il diametro idrodinamico medio previsto degli AgNP;le linee di tendenza medie Z misurate su NaCl 10, 50 e 150 mM mostrano valori diversi, gradualmente crescenti.Infine, in tutti e tre gli esperimenti da 150 mM sono stati rilevati aggregati di dimensioni micron.
Figura 5 I risultati della diffusione dinamica della luce del campione di nanoparticelle d'argento con terminazione citrato di dimensioni crescenti (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II e 50 nm: AgNP-III) sono espressi come diametro idrodinamico medio (Z media ) (a destra) e il potenziale zeta (a sinistra) cambiano entro 24 ore a diverse concentrazioni di NaCl.
I risultati UV-Vis nella Figura supplementare S2 mostrano che l'SPR di 50 e 150 mM NaCl in tutti e tre i campioni presenta una diminuzione istantanea e significativa.Ciò può essere spiegato dal DLS, poiché l'aggregazione basata su NaCl avviene più velocemente rispetto agli esperimenti dipendenti dal pH, il che è spiegato dalla grande differenza tra le misurazioni iniziali (0, 1,5 e 3 ore).Inoltre, l'aumento della concentrazione di sale aumenterà anche la permettività relativa del mezzo sperimentale, che avrà un profondo effetto sulla risonanza plasmonica superficiale.29
L'effetto di NaCl è riassunto nella riga centrale della Figura 4. In generale, si può concludere che l'aumento della concentrazione di cloruro di sodio ha un effetto simile all'aumento dell'acidità, perché gli ioni Na+ hanno la tendenza a coordinarsi attorno ai gruppi carbossilato, sopprimendo gli AgNP con potenziale zeta negativo.Inoltre, 150 mM di NaCl hanno prodotto aggregati di dimensioni micron in tutti e tre i campioni, indicando che la concentrazione fisiologica dell'elettrolita è dannosa per la stabilità colloidale degli AgNP con terminazione citrato.Considerando la concentrazione critica di condensazione (CCC) di NaCl su sistemi AgNP simili, questi risultati possono essere abilmente inseriti nella letteratura pertinente.Huynh et al.hanno calcolato che il CCC di NaCl per nanoparticelle d'argento citrato-terminate con un diametro medio di 71 nm era 47,6 mM, mentre El Badawy et al.osservato che il CCC degli AgNP da 10 nm con rivestimento in citrato era 70 mM.10,16 Inoltre, il CCC significativamente elevato di circa 300 mM è stato misurato da He et al., il che ha reso il loro metodo di sintesi diverso dalla pubblicazione menzionata in precedenza.48 Sebbene il presente contributo non sia finalizzato ad un'analisi completa di questi valori, poiché le nostre condizioni sperimentali stanno aumentando nella complessità dell'intero studio, la concentrazione biologicamente rilevante di NaCl di 50 mM, in particolare di NaCl di 150 mM, sembra essere piuttosto elevata.Coagulazione indotta, che spiega i forti cambiamenti rilevati.
Il passo successivo nell'esperimento di polimerizzazione consiste nell'utilizzare molecole semplici ma biologicamente rilevanti per simulare le interazioni nanoparticelle-biomolecole.Sulla base dei risultati DLS (figure 6 e 7) e UV-Vis (figure supplementari S3 e S4), si possono trarre alcune conclusioni generali.Nelle nostre condizioni sperimentali, le molecole studiate glucosio e glutammina non indurranno aggregazione in nessun sistema AgNP, poiché l'andamento della media Z è strettamente correlato al corrispondente valore di misurazione di riferimento.Sebbene la loro presenza non influisca sull'aggregazione, i risultati sperimentali mostrano che queste molecole sono parzialmente adsorbite sulla superficie degli AgNP.Il risultato più importante a sostegno di questa visione è il cambiamento osservato nell’assorbimento della luce.Sebbene l’AgNP-I non mostri cambiamenti significativi nella lunghezza d’onda o nell’intensità, può essere osservato più chiaramente misurando particelle più grandi, il che è molto probabilmente dovuto alla maggiore sensibilità ottica menzionata in precedenza.Indipendentemente dalla concentrazione, il glucosio può causare uno spostamento verso il rosso maggiore dopo 1,5 ore rispetto alla misurazione di controllo, che è di circa 40 nm in AgNP-II e di circa 10 nm in AgNP-III, il che dimostra la presenza di interazioni superficiali.La glutammina ha mostrato un andamento simile, ma il cambiamento non è stato così evidente.Inoltre, vale la pena ricordare che la glutammina può ridurre il potenziale zeta assoluto delle particelle medie e grandi.Tuttavia, poiché questi cambiamenti zeta non sembrano influenzare il livello di aggregazione, si può ipotizzare che anche piccole biomolecole come la glutammina possano fornire un certo grado di repulsione spaziale tra le particelle.
Figura 6 I risultati della diffusione dinamica della luce di campioni di nanoparticelle d'argento con terminazione citrato di dimensioni crescenti (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II e 50 nm: AgNP-III) sono espressi come diametro idrodinamico medio (Z media) (a destra) In condizioni esterne di diverse concentrazioni di glucosio, il potenziale zeta (a sinistra) cambia entro 24 ore.
Figura 7 I risultati della diffusione dinamica della luce del campione di nanoparticelle d'argento con terminazione citrato di dimensioni crescenti (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II e 50 nm: AgNP-III) sono espressi come diametro idrodinamico medio (Z media ) (a destra) In presenza di glutammina, il potenziale zeta (a sinistra) cambia entro 24 ore.
In breve, piccole biomolecole come glucosio e glutammina non influenzano la stabilità colloidale alla concentrazione misurata: sebbene influenzino il potenziale zeta e i risultati UV-Vis a vari livelli, i risultati della media Z non sono coerenti.Ciò indica che l'adsorbimento superficiale delle molecole inibisce la repulsione elettrostatica, ma allo stesso tempo fornisce stabilità dimensionale.
Per collegare i risultati precedenti con i risultati precedenti e simulare le condizioni biologiche in modo più abile, abbiamo selezionato alcuni dei componenti di colture cellulari più comunemente usati e li abbiamo utilizzati come condizioni sperimentali per studiare la stabilità dei colloidi AgNP.Nell'intero esperimento in vitro, una delle funzioni più importanti del DMEM come mezzo è quella di stabilire le condizioni osmotiche necessarie, ma da un punto di vista chimico si tratta di una soluzione salina complessa con una forza ionica totale simile a 150 mM NaCl .40 Per quanto riguarda l'FBS, si tratta di una miscela complessa di biomolecole, principalmente proteine, dal punto di vista dell'adsorbimento superficiale presenta alcune somiglianze con i risultati sperimentali del glucosio e della glutammina, nonostante la composizione chimica e la diversità sessuale è molto più complicata.19 DLS e UV-I risultati visibili mostrati rispettivamente nella Figura 8 e nella Figura supplementare S5 possono essere spiegati esaminando la composizione chimica di questi materiali e correlandoli con le misurazioni nella sezione precedente.
Figura 8 I risultati della diffusione dinamica della luce del campione di nanoparticelle d'argento con terminazione citrato di dimensioni crescenti (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II e 50 nm: AgNP-III) sono espressi come diametro idrodinamico medio (Z media ) (a destra) In presenza dei componenti della coltura cellulare DMEM e FBS, il potenziale zeta (a sinistra) cambia entro 24 ore.
La diluizione di AgNP di diverse dimensioni in DMEM ha un effetto simile sulla stabilità colloidale a quello osservato in presenza di elevate concentrazioni di NaCl.La dispersione di AgNP in DMEM al 50 v/v% ha mostrato che è stata rilevata un'aggregazione su larga scala con l'aumento del potenziale zeta e del valore medio Z e la forte diminuzione dell'intensità SPR.Vale la pena notare che la dimensione massima dell'aggregato indotta dal DMEM dopo 24 ore è inversamente proporzionale alla dimensione delle nanoparticelle del primer.
L'interazione tra FBS e AgNP è simile a quella osservata in presenza di molecole più piccole come glucosio e glutammina, ma l'effetto è più forte.La media Z delle particelle rimane inalterata, mentre si rileva un aumento del potenziale zeta.Il picco dell'SPR ha mostrato un leggero spostamento verso il rosso, ma, cosa forse più interessante, l'intensità dell'SPR non è diminuita in modo così significativo come nella misurazione di controllo.Questi risultati possono essere spiegati dall’adsorbimento innato di macromolecole sulla superficie delle nanoparticelle (riga inferiore nella Figura 4), che ora è inteso come la formazione della corona biomolecolare nel corpo.49