Javascript està actualment desactivat al vostre navegador.Quan javascript està desactivat, algunes funcions d'aquest lloc web no funcionaran.
Registreu les vostres dades específiques i medicaments específics d'interès, i relacionarem la informació que proporcioneu amb els articles de la nostra àmplia base de dades i us enviarem una còpia en PDF per correu electrònic de manera oportuna.
Les nanopartícules més petites sempre són millors?Comprendre els efectes biològics de l'agregació dependent de la mida de nanopartícules de plata en condicions biològicament rellevants
Autors: Bélteky P, Rónavári A, Zakupszky D, Boka E, Igaz N, Szerencsés B, Pfeiffer I, Vágvölgyi C, Kiricsi M, Kónya Z
Péter Bélteky,1,* Andrea Rónavári,1,* Dalma Zakupszky,1 Eszter Boka,1 Nóra Igaz,2 Bettina Szerencsés,3 Ilona Pfeiffer,3 Csaba Vágvölgyi,3 Mónika Kiricsi de Química Ambiental, Hongria, Facultat de Ciències i Informàtica d'Hongria , Universitat de Szeged;2 Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de Ciències i Informació, Universitat de Szeged, Hongria;3 Departament de Microbiologia, Facultat de Ciències i Informació, Universitat de Szeged, Hongria;4MTA-SZTE Reaction Kinetics and Surface Chemistry Research Group, Szeged, Hongria* Aquests autors van contribuir per igual a aquest treball.Comunicació: Zoltán Kónya Departament de Química Aplicada i Ambiental, Facultat de Ciències i Informàtica, Universitat de Szeged, Rerrich Square 1, Szeged, H-6720, Hongria Telèfon +36 62 544620 Correu electrònic [Protecció de correu electrònic] Propòsit: Les nanopartícules de plata (AgNP) són un dels nanomaterials més estudiats, sobretot per les seves aplicacions biomèdiques.Tanmateix, a causa de l'agregació de nanopartícules, la seva excel·lent citotoxicitat i activitat antibacteriana sovint es veuen compromeses en medis biològics.En aquest treball, es va estudiar el comportament d'agregació i les activitats biològiques relacionades de tres mostres diferents de nanopartícules de plata terminades amb citrat amb un diàmetre mitjà de 10, 20 i 50 nm.Mètode: Utilitzar el microscopi electrònic de transmissió per sintetitzar i caracteritzar nanopartícules, avaluar el seu comportament d'agregació a diversos valors de pH, concentracions de NaCl, glucosa i glutamina mitjançant dispersió de llum dinàmica i espectroscòpia ultraviolada visible.A més, en el medi de cultiu cel·lular components com Dulbecco milloren el comportament d'agregació en Eagle Medium i Fetal Calf Serum.Resultats: els resultats mostren que el pH àcid i el contingut fisiològic d'electròlits indueixen generalment una agregació a escala de micres, que pot estar mediada per la formació de corona biomolecular.Val la pena assenyalar que les partícules més grans presenten una major resistència a les influències externes que les seves contraparts més petites.Es van realitzar proves de citotoxicitat i antibacterians in vitro tractant cèl·lules amb agregats de nanopartícules en diferents etapes d'agregació.Conclusió: els nostres resultats revelen una profunda correlació entre l'estabilitat col·loïdal i la toxicitat dels AgNPs, ja que l'agregació extrema condueix a la pèrdua completa de l'activitat biològica.El grau més alt d'anti-agregació observat per a partícules més grans té un impacte significatiu en la toxicitat in vitro, perquè aquestes mostres conserven més activitat antimicrobiana i de cèl·lules de mamífers.Aquestes troballes porten a la conclusió que, malgrat l'opinió general de la literatura rellevant, pot ser que dirigir-se a les nanopartícules més petites possibles no sigui el millor curs d'acció.Paraules clau: creixement mediat per llavors, estabilitat col·loïdal, comportament d'agregació depenent de la mida, toxicitat del dany de l'agregació
A mesura que la demanda i la producció de nanomaterials segueixen augmentant, cada cop es presta més atenció a la seva bioseguretat o activitat biològica.Les nanopartícules de plata (AgNP) són un dels representants més comunament sintetitzats, investigats i utilitzats d'aquesta classe de materials a causa de les seves excel·lents propietats catalíticas, òptiques i biològiques.1 En general, es creu que les característiques úniques dels nanomaterials (inclosos els AgNP) s'atribueixen principalment a la seva gran superfície específica.Per tant, el problema inevitable és qualsevol procés que afecti aquesta característica clau, com ara la mida de les partícules, el recobriment superficial o l'agregació, tant si danyarà greument les propietats de les nanopartícules que són crítiques per a aplicacions específiques.
Els efectes de la mida de les partícules i els estabilitzadors són temes que han estat relativament ben documentats a la literatura.Per exemple, la visió generalment acceptada és que les nanopartícules més petites són més tòxiques que les nanopartícules més grans.2 D'acord amb la literatura general, els nostres estudis anteriors han demostrat l'activitat dependent de la mida de la nanoplata en cèl·lules i microorganismes de mamífers.3– 5 El recobriment superficial és un altre atribut que té una àmplia influència en les propietats dels nanomaterials.Només afegint o modificant estabilitzadors a la seva superfície, el mateix nanomaterial pot tenir propietats físiques, químiques i biològiques completament diferents.L'aplicació d'agents de captació es realitza amb més freqüència com a part de la síntesi de nanopartícules.Per exemple, les nanopartícules de plata terminades en citrat són un dels AgNP més rellevants de la investigació, que es sintetitzen reduint sals de plata en una solució estabilitzadora seleccionada com a medi de reacció.6 El citrat pot aprofitar fàcilment el seu baix cost, disponibilitat, biocompatibilitat i gran afinitat per la plata, que es pot reflectir en diverses interaccions proposades, des de l'adsorció superficial reversible fins a les interaccions iòniques.Les molècules petites i els ions poliatòmics propers a 7,8, com ara citrats, polímers, polielectròlits i agents biològics també s'utilitzen habitualment per estabilitzar la nanoplata i realitzar-hi funcionalitzacions úniques.9-12
Tot i que la possibilitat d'alterar l'activitat de les nanopartícules mitjançant la cobertura superficial intencionada és una àrea molt interessant, el paper principal d'aquest recobriment superficial és insignificant, proporcionant estabilitat col·loïdal al sistema de nanopartícules.La gran superfície específica dels nanomaterials produirà una gran energia superficial, la qual cosa dificulta la capacitat termodinàmica del sistema per assolir la seva energia mínima.13 Sense una estabilització adequada, això pot conduir a l'aglomeració de nanomaterials.L'agregació és la formació d'agregats de partícules de diverses formes i mides que es produeix quan les partícules disperses es troben i les interaccions termodinàmiques actuals permeten que les partícules s'adhereixin entre si.Per tant, s'utilitzen estabilitzadors per evitar l'agregació introduint una força repulsiva prou gran entre les partícules per contrarestar la seva atracció termodinàmica.14
Tot i que el tema de la mida de les partícules i la cobertura de la superfície s'ha explorat a fons en el context de la seva regulació de les activitats biològiques desencadenadas per les nanopartícules, l'agregació de partícules és una àrea molt descuidada.Gairebé no hi ha cap estudi exhaustiu per resoldre l'estabilitat col·loïdal de les nanopartícules en condicions biològicament rellevants.10,15-17 A més, aquesta contribució és especialment rara, on també s'ha estudiat la toxicitat associada a l'agregació, encara que pugui provocar reaccions adverses, com la trombosi vascular, o la pèrdua de les característiques desitjades, com la seva toxicitat, com ara es mostra a la figura 1.18, 19 mostrada.De fet, un dels pocs mecanismes coneguts de resistència a les nanopartícules de plata està relacionat amb l'agregació, perquè s'informa que determinades soques d'E. coli i Pseudomonas aeruginosa redueixen la seva sensibilitat a la nano-plata expressant la proteïna flagel·lina, la flagel·lina.Té una alta afinitat per la plata, induint així l'agregació.20
Hi ha diversos mecanismes diferents relacionats amb la toxicitat de les nanopartícules de plata, i l'agregació afecta tots aquests mecanismes.El mètode més discutit d'activitat biològica AgNP, de vegades conegut com el mecanisme del "cavall de Troia", considera els AgNP com a portadors Ag+.1,21 El mecanisme del cavall de Troia pot assegurar un gran augment de la concentració local d'Ag +, que condueix a la generació de ROS i a la despolarització de la membrana.22-24 L'agregació pot afectar l'alliberament d'Ag+, afectant així la toxicitat, perquè redueix la superfície activa efectiva on els ions de plata es poden oxidar i dissoldre.Tanmateix, els AgNP no només mostraran toxicitat mitjançant l'alliberament d'ions.S'han de tenir en compte moltes interaccions relacionades amb la mida i la morfologia.Entre ells, la mida i la forma de la superfície de les nanopartícules són les característiques definitòries.4,25 La col·lecció d'aquests mecanismes es pot classificar com a "mecanismes de toxicitat induïda".Hi ha potencialment moltes reaccions de membrana mitocondrial i superficial que poden danyar els orgànuls i causar la mort cel·lular.25-27 Com que la formació d'agregats afecta naturalment la mida i la forma dels objectes que contenen plata reconeguts pels sistemes vius, aquestes interaccions també es poden veure afectades.
En el nostre article anterior sobre l'agregació de nanopartícules de plata, vam demostrar un procediment de cribratge eficaç que consistia en experiments químics i biològics in vitro per estudiar aquest problema.19 La dispersió de llum dinàmica (DLS) és la tècnica preferida per a aquest tipus d'inspeccions perquè el material pot dispersar fotons a una longitud d'ona comparable a la mida de les seves partícules.Com que la velocitat de moviment brownià de les partícules en el medi líquid està relacionada amb la mida, el canvi en la intensitat de la llum dispersa es pot utilitzar per determinar el diàmetre hidrodinàmic mitjà (mitjana Z) de la mostra líquida.28 A més, aplicant una tensió a la mostra, el potencial zeta (potencial ζ) de la nanopartícula es pot mesurar de manera similar al valor mitjà Z.13,28 Si el valor absolut del potencial zeta és prou alt (segons directrius generals> ± 30 mV), generarà una forta repulsió electrostàtica entre les partícules per contrarestar l'agregació.La ressonància plasmònica superficial característica (SPR) és un fenomen òptic únic, atribuït principalment a nanopartícules de metalls preciosos (principalment Au i Ag).29​​ A partir de les oscil·lacions electròniques (plasmons superficials) d'aquests materials a escala nanomètrica, se sap que els AgNP esfèrics tenen un pic d'absorció UV-Vis característic prop de 400 nm.30 La intensitat i el canvi de longitud d'ona de les partícules s'utilitzen per complementar els resultats del DLS, ja que aquest mètode es pot utilitzar per detectar l'agregació de nanopartícules i l'adsorció superficial de biomolècules.
A partir de la informació obtinguda, es realitzen assajos de viabilitat cel·lular (MTT) i antibacterians de manera que la toxicitat d'AgNP es descriu en funció del nivell d'agregació, en lloc de (el factor més utilitzat) la concentració de nanopartícules.Aquest mètode únic ens permet demostrar la profunda importància del nivell d'agregació en l'activitat biològica, perquè, per exemple, els AgNP terminats en citrats perden completament la seva activitat biològica en poques hores a causa de l'agregació.19
En el treball actual, pretenem ampliar en gran mesura les nostres contribucions anteriors en l'estabilitat dels col·loides bio-relacionats i el seu impacte en l'activitat biològica mitjançant l'estudi de l'efecte de la mida de les nanopartícules sobre l'agregació de nanopartícules.Aquest és, sens dubte, un dels estudis de nanopartícules.Una perspectiva de perfil superior i 31 Per investigar aquest problema, es va utilitzar un mètode de creixement mediat per llavors per produir AgNPs terminats amb citrat en tres rangs de mida diferents (10, 20 i 50 nm).6,32 com un dels mètodes més comuns.Per als nanomaterials que s'utilitzen àmpliament i rutinàriament en aplicacions mèdiques, es seleccionen AgNPs terminats amb citrats de diferents mides per estudiar la possible dependència de la mida de les propietats biològiques relacionades amb l'agregació del nanoplata.Després de sintetitzar AgNPs de diferents mides, vam caracteritzar les mostres produïdes mitjançant microscòpia electrònica de transmissió (TEM) i després vam examinar les partícules mitjançant el procediment de cribratge esmentat anteriorment.A més, en presència de cultius cel·lulars in vitro, Mitjà d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM) i Sèrum Boví Fetal (FBS), es va avaluar el comportament d'agregació depenent de la mida i el seu comportament a diversos valors de pH, NaCl, glucosa i concentracions de glutamina.Les característiques de la citotoxicitat es determinen en condicions globals.El consens científic indica que, en general, són preferibles les partícules més petites;la nostra investigació proporciona una plataforma química i biològica per determinar si aquest és el cas.
Es van preparar tres nanopartícules de plata amb diferents rangs de mida mitjançant el mètode de creixement mediat per llavors proposat per Wan et al., amb lleugers ajustaments.6 Aquest mètode es basa en la reducció química, utilitzant nitrat de plata (AgNO3) com a font de plata, borohidrur de sodi (NaBH4) com a agent reductor i citrat de sodi com a estabilitzador.Primer, prepareu 75 ml de solució aquosa de citrat de 9 mM a partir de citrat de sodi dihidrat (Na3C6H5O7 x 2H2O) i escalfeu-lo a 70 °C.A continuació, es van afegir 2 ml de solució d'AgNO3 a l'1% p/v al medi de reacció i, a continuació, es va abocar gota a gota la solució de borohidrur de sodi acabada de preparar (2 ml 0, 1% p/v).La suspensió de color groc-marró resultant es va mantenir a 70 ° C amb una agitació vigorosa durant 1 hora i després es va refredar a temperatura ambient.La mostra resultant (a partir d'ara anomenada AgNP-I) s'utilitza com a base per al creixement mediat per llavors en el següent pas de síntesi.
Per sintetitzar una suspensió de partícules de mida mitjana (indicada com AgNP-II), escalfeu 90 ml de solució de citrat de 7,6 mM a 80 °C, barregeu-la amb 10 ml d'AgNP-I i després barregeu 2 ml 1% p/v La solució AgNO3 es va mantenir sota agitació mecànica vigorosa durant 1 hora, i després la mostra es va refredar a temperatura ambient.
Per a la partícula més gran (AgNP-III), repetiu el mateix procés de creixement, però en aquest cas, utilitzeu 10 ml d'AgNP-II com a suspensió de llavors.Després que les mostres arribin a temperatura ambient, estableixen la seva concentració nominal d'Ag en funció del contingut total d'AgNO3 a 150 ppm afegint o evaporant dissolvent addicional a 40 °C i, finalment, les emmagatzemen a 4 °C fins a un nou ús.
Utilitzeu el microscopi electrònic de transmissió (TEM) FEI Tecnai G2 20 X-Twin (seu corporativa de FEI, Hillsboro, Oregon, EUA) amb una tensió d'acceleració de 200 kV per examinar les característiques morfològiques de les nanopartícules i capturar el seu patró de difracció d'electrons (ED).Es van avaluar almenys 15 imatges representatives (~ 750 partícules) mitjançant el paquet de programari ImageJ, i els histogrames resultants (i tots els gràfics de tot l'estudi) es van crear a OriginPro 2018 (OriginLab, Northampton, MA, EUA) 33, 34.
Es van mesurar el diàmetre hidrodinàmic mitjà (mitjana Z), el potencial zeta (potencial ζ) i la ressonància plasmònica superficial característica (SPR) de les mostres per il·lustrar les seves propietats col·loïdals inicials.El diàmetre hidrodinàmic mitjà i el potencial zeta de la mostra es van mesurar amb l'instrument Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, Regne Unit) mitjançant cèl·lules capil·lars plegades d'un sol ús a 37 ± 0, 1 ° C.Es va utilitzar l'espectrofotòmetre UV-Vis Ocean Optics 355 DH-2000-BAL (Halma PLC, Largo, FL, EUA) per obtenir les característiques SPR característiques dels espectres d'absorció UV-Vis de mostres en el rang de 250-800 nm.
Durant tot l'experiment, es van realitzar simultàniament tres tipus de mesura diferents relacionats amb l'estabilitat col·loïdal.Utilitzeu DLS per mesurar el diàmetre hidrodinàmic mitjà (mitjana Z) i el potencial zeta (potencial ζ) de les partícules, perquè la mitjana Z està relacionada amb la mida mitjana dels agregats de nanopartícules i el potencial zeta indica si la repulsió electrostàtica del sistema és prou fort com per compensar l'atracció de Van der Waals entre nanopartícules.Les mesures es fan per triplicat, i el programari Zetasizer calcula la desviació estàndard de la mitjana Z i del potencial zeta.Els espectres SPR característics de les partícules s'avaluen mitjançant espectroscòpia UV-Vis, perquè els canvis en la intensitat màxima i la longitud d'ona poden indicar agregació i interaccions superficials.29,35 De fet, la ressonància plasmònica superficial en metalls preciosos té tanta influència que ha donat lloc a nous mètodes d'anàlisi de biomolècules.29,36,37 La concentració d'AgNP a la mescla experimental és d'unes 10 ppm, i el propòsit és establir la intensitat de l'absorció màxima de SPR inicial a 1. L'experiment es va dur a terme de manera dependent del temps a 0;1,5;3;6;12 i 24 hores sota diverses condicions biològicament rellevants.Es poden veure més detalls que descriuen l'experiment al nostre treball anterior.19 En resum, diversos valors de pH (3; 5; 7,2 i 9), diferents concentracions de clorur de sodi (10 mM; 50 mM; 150 mM), glucosa (3,9 mM; 6,7 mM) i glutamina (4 mM), i també va preparar el medi d'àguila modificat (DMEM) de Dulbecco i el sèrum boví fetal (FBS) (en aigua i DMEM) com a sistemes model, i va estudiar els seus efectes sobre el comportament d'agregació de les nanopartícules de plata sintetitzades.pH Els valors de, NaCl, glucosa i glutamina s'avaluen en funció de les concentracions fisiològiques, mentre que les quantitats de DMEM i FBS són les mateixes que els nivells utilitzats en tot l'experiment in vitro.38-42 Totes les mesures es van realitzar a pH 7,2 i 37 °C amb una concentració constant de sal de fons de 10 mM de NaCl per eliminar qualsevol interacció de partícules a llarga distància (excepte per a certs experiments relacionats amb el pH i el NaCl, on aquests atributs són les variables sota estudiar).28 La llista de diverses condicions es resumeix a la taula 1. L'experiment marcat amb † s'utilitza com a referència i correspon a una mostra que conté NaCl 10 mM i pH 7,2.
La línia cel·lular de càncer de pròstata humana (DU145) i els queratinòcits humans immortalitzats (HaCaT) es van obtenir d'ATCC (Manassas, VA, EUA).Les cèl·lules es cultiven rutinàriament en el medi essencial mínim Eagle (DMEM) de Dulbecco que conté 4,5 g/L de glucosa (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EUA), complementat amb un 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 0,01% d'estreptomicina i 0,005% Penicil·lina (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA).Les cèl·lules es cultiven en una incubadora a 37 °C amb un 5% de CO2 i un 95% d'humitat.
Per explorar els canvis en la citotoxicitat d'AgNP causats per l'agregació de partícules de manera dependent del temps, es va realitzar un assaig MTT en dos passos.En primer lloc, es va mesurar la viabilitat dels dos tipus de cèl·lules després del tractament amb AgNP-I, AgNP-II i AgNP-III.Amb aquesta finalitat, els dos tipus de cèl·lules es van sembrar en plaques de 96 pous a una densitat de 10.000 cèl·lules/pou i es van tractar amb tres mides diferents de nanopartícules de plata en concentracions creixents el segon dia.Després de 24 hores de tractament, les cèl·lules es van rentar amb PBS i es van incubar amb 0, 5 mg/mL de reactiu MTT (SERVA, Heidelberg, Alemanya) diluït en medi de cultiu durant 1 hora a 37 °C.Els cristalls de formazan es van dissoldre en DMSO (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EUA) i l'absorció es va mesurar a 570 nm mitjançant un lector de plaques Synergy HTX (BioTek-Hungary, Budapest, Hongria).Es considera que el valor d'absorció de la mostra de control no tractada és una taxa de supervivència del 100%.Realitzeu almenys 3 experiments utilitzant quatre rèpliques biològiques independents.L'IC50 es calcula a partir d'una corba de dosi resposta basada en els resultats de vitalitat.
Després, en el segon pas, incubant les partícules amb 150 mM de NaCl durant diferents períodes de temps (0, 1,5, 3, 6, 12 i 24 hores) abans del tractament cel·lular, es van produir diferents estats d'agregació de nanopartícules de plata.Posteriorment, es va realitzar el mateix assaig MTT que s'ha descrit anteriorment per avaluar els canvis en la viabilitat cel·lular afectats per l'agregació de partícules.Utilitzeu GraphPad Prism 7 per avaluar el resultat final, calcular la significació estadística de l'experiment mitjançant una prova t no aparellada i marcar el seu nivell com a * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01), *** (p ≤ 0,001). ) I **** (p ≤ 0,0001).
Es van utilitzar tres mides diferents de nanopartícules de plata (AgNP-I, AgNP-II i AgNP-III) per a la susceptibilitat antibacteriana a Cryptococcus neoformans IFM 5844 (IFM; Centre de recerca de fongs patògens i toxicologia microbiana, Universitat de Chiba) i Bacillus Test megaterium SZMC 60311. (SZMC: Szeged Microbiology Collection) i E. coli SZMC 0582 en medi RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Co.).Per avaluar els canvis en l'activitat antibacteriana causats per l'agregació de partícules, en primer lloc, es va determinar la seva concentració inhibitòria mínima (MIC) mitjançant microdilució en una placa de microtitulació de 96 pous.A 50 μL de suspensió cel·lular estandarditzada (5 × 104 cèl·lules/mL en medi RPMI 1640), afegiu 50 μL de suspensió de nanopartícules de plata i diluïu en sèrie dues vegades la concentració (en el medi esmentat, el rang és de 0 i 75 ppm, és a dir, la mostra de control conté 50 μL de suspensió cel·lular i 50 μL de medi sense nanopartícules).Després, la placa es va incubar a 30 ° C durant 48 hores i es va mesurar la densitat òptica del cultiu a 620 nm mitjançant un lector de plaques SPECTROstar Nano (BMG LabTech, Offenburg, Alemanya).L'experiment es va realitzar tres vegades per triplicat.
Excepte que en aquest moment es van utilitzar 50 μL de mostres de nanopartícules agregades individuals, es va utilitzar el mateix procediment que s'ha descrit anteriorment per examinar l'efecte de l'agregació sobre l'activitat antibacteriana de les soques esmentades anteriorment.Es produeixen diferents estats d'agregació de nanopartícules de plata incubant les partícules amb NaCl 150 mM durant diferents períodes de temps (0, 1,5, 3, 6, 12 i 24 hores) abans del processament cel·lular.Es va utilitzar una suspensió complementada amb 50 μL de medi RPMI 1640 com a control del creixement, mentre que per controlar la toxicitat es va utilitzar una suspensió amb nanopartícules no agregades.L'experiment es va realitzar tres vegades per triplicat.Utilitzeu GraphPad Prism 7 per tornar a avaluar el resultat final, utilitzant la mateixa anàlisi estadística que l'anàlisi MTT.
S'ha caracteritzat el nivell d'agregació de les partícules més petites (AgNP-I) i els resultats es van publicar parcialment en el nostre treball anterior, però per a una millor comparació, totes les partícules es van examinar a fons.Les dades experimentals es recullen i es discuteixen a les seccions següents.Tres mides d'AgNP.19
Les mesures realitzades per TEM, UV-Vis i DLS van verificar l'èxit de la síntesi de totes les mostres d'AgNP (figura 2A-D).Segons la primera fila de la figura 2, la partícula més petita (AgNP-I) mostra una morfologia esfèrica uniforme amb un diàmetre mitjà d'uns 10 nm.El mètode de creixement mediat per llavors també proporciona AgNP-II i AgNP-III amb diferents rangs de mida amb diàmetres mitjans de partícules d'aproximadament 20 nm i 50 nm, respectivament.Segons la desviació estàndard de la distribució de partícules, les mides de les tres mostres no es superposen, cosa que és important per a la seva anàlisi comparativa.En comparar la relació d'aspecte mitjana i la relació de primesa de les projeccions 2D de partícules basades en TEM, se suposa que l'esfericitat de les partícules s'avalua mitjançant el connector de filtre de forma d'ImageJ (figura 2E).43 Segons l'anàlisi de la forma de les partícules, la seva relació d'aspecte (costat gran/costat curt del rectangle delimitador més petit) no es veu afectada pel creixement de partícules i la seva proporció de primesa (àrea mesurada del cercle perfecte/àrea teòrica corresponent). ) disminueix gradualment.Això dóna lloc a més i més partícules polièdriques, que en teoria són perfectament rodones, que corresponen a una proporció de primesa d'1.
Figura 2 Imatge de microscopi electrònic de transmissió (TEM) (A), patró de difracció d'electrons (ED) (B), histograma de distribució de mida (C), espectre d'absorció de llum ultraviolada-visible (UV-Vis) característic (D) i citrat fluid mitjà -Les nanopartícules de plata acabades amb diàmetre mecànic (mitjana Z), potencial zeta, relació d'aspecte i relació de gruix (E) tenen tres rangs de mida diferents: AgNP-I és de 10 nm (fila superior), AgNP -II és de 20 nm (fila mitjana). ), AgNP-III (fila inferior) és de 50 nm.
Tot i que la naturalesa cíclica del mètode de creixement va afectar la forma de les partícules fins a cert punt, donant lloc a la menor esfericitat dels AgNPs més grans, les tres mostres es van mantenir quasi esfèriques.A més, tal com es mostra al patró de difracció d'electrons de la figura 2B, nano La cristalinitat de les partícules no es veu afectada.El destacat anell de difracció, que es pot correlacionar amb els índexs de Miller (111), (220), (200 i (311) de la plata, és molt coherent amb la literatura científica i les nostres contribucions anteriors.9, 19,44 La fragmentació de l'anell Debye-Scherrer d'AgNP-II i AgNP-III es deu al fet que la imatge ED es captura amb el mateix augment, de manera que a mesura que augmenta la mida de la partícula, el nombre de partícules difractades per la unitat d'àrea augmenta i disminueix.
Se sap que la mida i la forma de les nanopartícules afecten l'activitat biològica.3,45 L'activitat catalítica i biològica depenent de la forma es pot explicar pel fet que diferents formes tendeixen a proliferar determinades cares de cristall (que tenen diferents índexs de Miller), i aquestes cares de cristall tenen activitats diferents.45,46 Atès que les partícules preparades proporcionen resultats ED similars corresponents a característiques de cristall molt similars, es pot suposar que en els nostres experiments posteriors d'estabilitat col·loïdal i activitat biològica, les diferències observades s'han d'atribuir a la mida de les nanopartícules, no a les propietats relacionades amb la forma.
Els resultats UV-Vis resumits a la figura 2D emfatitzen encara més la naturalesa esfèrica aclaparadora de l'AgNP sintetitzat, perquè els pics SPR de les tres mostres són al voltant de 400 nm, que és un valor característic de les nanopartícules esfèriques de plata.29,30 Els espectres capturats també van confirmar l'èxit del creixement mediat per llavors de nanoplata.A mesura que augmenta la mida de la partícula, la longitud d'ona corresponent a la màxima absorció de llum d'AgNP-II, de manera més destacada, segons la literatura, AgNP-III va experimentar un desplaçament cap al vermell.6,29
Pel que fa a l'estabilitat col·loïdal inicial del sistema AgNP, es va utilitzar DLS per mesurar el diàmetre hidrodinàmic mitjà i el potencial zeta de les partícules a pH 7,2.Els resultats que es mostren a la figura 2E mostren que AgNP-III té una estabilitat col·loïdal més alta que AgNP-I o AgNP-II, perquè les directrius comunes indiquen que un potencial zeta de 30 mV absolut és necessari per a l'estabilitat col·loïdal a llarg termini. Aquesta troballa es recolza encara més quan el valor mitjà Z (obtingut com a diàmetre hidrodinàmic mitjà de partícules lliures i agregades) es compara amb la mida de partícula primària obtinguda per TEM, perquè com més a prop estiguin els dos valors, més suau serà el grau de recollida a la mostra.De fet, la mitjana Z d'AgNP-I i AgNP-II és raonablement superior a la seva mida de partícula principal avaluada per TEM, de manera que, en comparació amb AgNP-III, es preveu que aquestes mostres tinguin més probabilitats d'agregar-se, on el potencial zeta altament negatiu s'acompanya d'una mida propera El valor mitjà Z.
L'explicació d'aquest fenomen pot ser doble.D'una banda, la concentració de citrat es manté a un nivell similar en tots els passos de síntesi, proporcionant una quantitat relativament alta de grups de superfície carregats per evitar que disminueixi la superfície específica de les partícules en creixement.Tanmateix, segons Levak et al., les molècules petites com el citrat es poden intercanviar fàcilment per biomolècules a la superfície de les nanopartícules.En aquest cas, l'estabilitat col·loïdal vindrà determinada per la corona de les biomolècules produïdes.31 Com que aquest comportament també es va observar en les nostres mesures d'agregació (que es comentarà amb més detall més endavant), la limitació de citrat per si sola no pot explicar aquest fenomen.
D'altra banda, la mida de la partícula és inversament proporcional a la tendència d'agregació a nivell nanomètric.Això està recolzat principalment pel mètode tradicional Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO), on l'atracció de partícules es descriu com la suma de les forces atractives i repulsives entre partícules.Segons He et al., el valor màxim de la corba d'energia DLVO disminueix amb la mida de les nanopartícules de les nanopartícules d'hematita, facilitant l'assoliment de l'energia primària mínima, promovent així l'agregació irreversible (condensació).47 Tanmateix, s'especula que hi ha altres aspectes més enllà de les limitacions de la teoria DLVO.Tot i que la gravetat de van der Waals i la repulsió electrostàtica de doble capa són similars amb l'augment de la mida de les partícules, una revisió de Hotze et al.proposa que té un efecte més fort sobre l'agregació del que permet DLVO.14 Creuen que la curvatura superficial de les nanopartícules ja no es pot estimar com una superfície plana, cosa que fa que l'estimació matemàtica sigui inaplicable.A més, a mesura que la mida de la partícula disminueix, el percentatge d'àtoms presents a la superfície augmenta, donant lloc a una estructura electrònica i un comportament de càrrega superficial.I la reactivitat superficial canvia, cosa que pot provocar una disminució de la càrrega a la doble capa elèctrica i afavorir l'agregació.
En comparar els resultats DLS d'AgNP-I, AgNP-II i AgNP-III a la figura 3, vam observar que les tres mostres mostraven un pH similar que va provocar l'agregació.Un entorn molt àcid (pH 3) canvia el potencial zeta de la mostra a 0 mV, fent que les partícules formin agregats de mida micres, mentre que el pH alcalí canvia el seu potencial zeta a un valor negatiu més gran, on les partícules formen agregats més petits (pH 5). ).I 7,2) ), o romanen completament sense agregar (pH 9).També es van observar algunes diferències importants entre les diferents mostres.Al llarg de l'experiment, AgNP-I va demostrar ser el més sensible als canvis de potencial zeta induïts pel pH, perquè el potencial zeta d'aquestes partícules s'ha reduït a pH 7,2 en comparació amb pH 9, mentre que AgNP-II i AgNP-III només mostraven A. un canvi considerable en ζ és al voltant del pH 3. A més, AgNP-II va mostrar canvis més lents i un potencial zeta moderat, mentre que AgNP-III va mostrar el comportament més suau dels tres, perquè el sistema va mostrar el valor zeta absolut més alt i el moviment de tendència lent, cosa que indica AgNP-III Més resistent a l'agregació induïda pel pH.Aquests resultats són coherents amb els resultats de la mesura del diàmetre hidrodinàmic mitjà.Tenint en compte la mida de partícules dels seus primers, AgNP-I va mostrar una agregació gradual constant a tots els valors de pH, molt probablement a causa del fons de NaCl 10 mM, mentre que AgNP-II i AgNP-III només van mostrar significatius a pH 3 de recollida.La diferència més interessant és que, malgrat la seva gran mida de nanopartícules, AgNP-III forma els agregats més petits a pH 3 en 24 hores, destacant les seves propietats anti-agregació.En dividir la Z mitjana d'AgNPs a pH 3 després de 24 hores pel valor de la mostra preparada, es pot observar que les mides agregades relatives d'AgNP-I i AgNP-II han augmentat 50 vegades, 42 vegades i 22 vegades. , respectivament.III.
Figura 3 Els resultats de la dispersió de la llum dinàmica de la mostra de nanopartícules de plata acabades amb citrats amb mida creixent (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II i 50 nm: AgNP-III) s'expressen com el diàmetre hidrodinàmic mitjà (Z mitjana). ) (dreta) En condicions de pH diferents, el potencial zeta (esquerra) canvia en 24 hores.
L'agregació depenent del pH observada també va afectar la característica ressonància plasmònica superficial (SPR) de les mostres d'AgNP, tal com ho demostren els seus espectres UV-Vis.Segons la figura suplementària S1, l'agregació de les tres suspensions de nanopartícules de plata va seguida d'una reducció de la intensitat dels seus pics SPR i un canvi al vermell moderat.L'extensió d'aquests canvis en funció del pH és coherent amb el grau d'agregació previst pels resultats del DLS, però, s'han observat algunes tendències interessants.Contràriament a la intuïció, resulta que l'AgNP-II de mida mitjana és la més sensible als canvis de SPR, mentre que les altres dues mostres són menys sensibles.En la investigació SPR, 50 nm és el límit teòric de mida de partícules, que s'utilitza per distingir les partícules en funció de les seves propietats dielèctriques.Les partícules menors de 50 nm (AgNP-I i AgNP-II) es poden descriure com a dipols dielèctrics simples, mentre que les partícules que arriben o superen aquest límit (AgNP-III) tenen propietats dielèctriques més complexes, i la seva ressonància La banda es divideix en canvis multimodals. .En el cas de dues mostres de partícules més petites, els AgNP es poden considerar dipols simples i el plasma es pot solapar fàcilment.A mesura que augmenta la mida de la partícula, aquest acoblament produeix essencialment un plasma més gran, cosa que pot explicar la major sensibilitat observada.29 Tanmateix, per a les partícules més grans, l'estimació del dipol simple no és vàlida quan també es poden produir altres estats d'acoblament, cosa que pot explicar la tendència disminuïda d'AgNP-III a indicar canvis espectrals.29
En les nostres condicions experimentals, s'ha demostrat que el valor del pH té un efecte profund sobre l'estabilitat col·loïdal de nanopartícules de plata recobertes de citrat de diverses mides.En aquests sistemes, l'estabilitat la proporcionen els grups -COO- carregats negativament a la superfície dels AgNP.El grup funcional carboxilat de l'ió citrat està protonat en un gran nombre d'ions H+, de manera que el grup carboxil generat ja no pot proporcionar repulsió electrostàtica entre les partícules, tal com es mostra a la fila superior de la figura 4. Segons el principi de Le Chatelier, AgNP les mostres s'agreguen ràpidament a pH 3, però gradualment es tornen més i més estables a mesura que augmenta el pH.
Figura 4 Mecanisme esquemàtic d'interacció superficial definit per agregació sota diferents pH (fila superior), concentració de NaCl (fila mitjana) i biomolècules (fila inferior).
Segons la figura 5, també es va examinar l'estabilitat col·loïdal en suspensions d'AgNP de diferents mides amb concentracions creixents de sal.A partir del potencial zeta, l'augment de la mida de les nanopartícules en aquests sistemes AgNP terminats amb citrat torna a proporcionar una resistència millorada a les influències externes del NaCl.En AgNP-I, 10 mM de NaCl és suficient per induir una agregació lleu, i una concentració de sal de 50 mM proporciona resultats molt similars.En AgNP-II i AgNP-III, NaCl 10 mM no afecta significativament el potencial zeta perquè els seus valors es mantenen en (AgNP-II) o per sota (AgNP-III) -30 mV.Augmentar la concentració de NaCl a 50 mM i finalment a 150 mM NaCl és suficient per reduir significativament el valor absolut del potencial zeta en totes les mostres, tot i que les partícules més grans retenen més càrrega negativa.Aquests resultats són coherents amb el diàmetre hidrodinàmic mitjà esperat dels AgNPs;les línies de tendència mitjanes Z mesurades a 10, 50 i 150 mM de NaCl mostren valors diferents que augmenten gradualment.Finalment, es van detectar agregats de mida micres en els tres experiments de 150 mM.
Figura 5 Els resultats de la dispersió de la llum dinàmica de la mostra de nanopartícules de plata terminades amb citrats amb mida creixent (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II i 50 nm: AgNP-III) s'expressen com el diàmetre hidrodinàmic mitjà (Z mitjana). ) (dreta) i el potencial zeta (esquerra) canvien en 24 hores a diferents concentracions de NaCl.
Els resultats UV-Vis de la figura suplementària S2 mostren que el SPR de 50 i 150 mM de NaCl a les tres mostres té una disminució instantània i significativa.Això es pot explicar amb DLS, perquè l'agregació basada en NaCl es produeix més ràpidament que els experiments que depenen del pH, la qual cosa s'explica per la gran diferència entre les primeres mesures (0, 1, 5 i 3 hores).A més, augmentar la concentració de sal també augmentarà la permitivitat relativa del medi experimental, la qual cosa tindrà un efecte profund sobre la ressonància del plasmó superficial.29
L'efecte del NaCl es resumeix a la fila del mig de la figura 4. En general, es pot concloure que augmentar la concentració de clorur de sodi té un efecte similar a l'augment de l'acidesa, perquè els ions Na+ tenen tendència a coordinar-se al voltant dels grups carboxilats, suprimint AgNPs potencial zeta negatius.A més, 150 mM de NaCl van produir agregats de mida micres a les tres mostres, cosa que indica que la concentració fisiològica d'electròlits és perjudicial per a l'estabilitat col·loïdal dels AgNPs terminats amb citrat.Tenint en compte la concentració crítica de condensació (CCC) de NaCl en sistemes AgNP similars, aquests resultats es poden col·locar de manera intel·ligent a la literatura rellevant.Huynh et al.va calcular que el CCC de NaCl per a nanopartícules de plata terminades amb citrat amb un diàmetre mitjà de 71 nm era de 47, 6 mM, mentre que El Badawy et al.va observar que el CCC de 10 nm AgNPs amb recobriment de citrat era de 70 mM.10,16 A més, el CCC significativament alt d'uns 300 mM va ser mesurat per He et al., La qual cosa va fer que el seu mètode de síntesi fos diferent de la publicació esmentada anteriorment.48 Tot i que la contribució actual no està dirigida a una anàlisi exhaustiva d'aquests valors, perquè les nostres condicions experimentals augmenten en la complexitat de tot l'estudi, la concentració de NaCl biològicament rellevant de 50 mM, especialment NaCl 150 mM, sembla ser força elevada.Coagulació induïda, explicant els forts canvis detectats.
El següent pas de l'experiment de polimerització és utilitzar molècules simples però biològicament rellevants per simular interaccions nanopartícules-biomolècules.A partir dels resultats de DLS (figures 6 i 7) i UV-Vis (figures suplementàries S3 i S4), es poden afirmar algunes conclusions generals.En les nostres condicions experimentals, les molècules estudiades glucosa i glutamina no induiran l'agregació en cap sistema AgNP, perquè la tendència Z-mean està estretament relacionada amb el valor de mesura de referència corresponent.Tot i que la seva presència no afecta l'agregació, els resultats experimentals mostren que aquestes molècules s'adsorbeixen parcialment a la superfície dels AgNP.El resultat més destacat que recolza aquesta visió és el canvi observat en l'absorció de la llum.Tot i que AgNP-I no presenta canvis significatius de longitud d'ona o intensitat, es pot observar amb més claredat mesurant partícules més grans, cosa que probablement es deu a la major sensibilitat òptica esmentada anteriorment.Independentment de la concentració, la glucosa pot provocar un major desplaçament cap al vermell després d'1,5 hores en comparació amb la mesura de control, que és d'uns 40 nm en AgNP-II i uns 10 nm en AgNP-III, cosa que demostra l'ocurrència d'interaccions superficials.La glutamina va mostrar una tendència similar, però el canvi no era tan evident.A més, també val la pena esmentar que la glutamina pot reduir el potencial zeta absolut de les partícules mitjanes i grans.Tanmateix, com que aquests canvis zeta no semblen afectar el nivell d'agregació, es pot especular que fins i tot les biomolècules petites com la glutamina poden proporcionar un cert grau de repulsió espacial entre les partícules.
Figura 6 Els resultats de la dispersió de la llum dinàmica de mostres de nanopartícules de plata terminades amb citrats amb mida creixent (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II i 50 nm: AgNP-III) s'expressen com el diàmetre hidrodinàmic mitjà (mitjana Z) (dreta) En condicions externes de diferents concentracions de glucosa, el potencial zeta (esquerra) canvia en 24 hores.
Figura 7 Els resultats de la dispersió de la llum dinàmica de la mostra de nanopartícules de plata terminades amb citrats amb mida creixent (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II i 50 nm: AgNP-III) s'expressen com el diàmetre hidrodinàmic mitjà (Z mitjana). ) (dreta) En presència de glutamina, el potencial zeta (esquerra) canvia en 24 hores.
En resum, les biomolècules petites com la glucosa i la glutamina no afecten l'estabilitat col·loïdal a la concentració mesurada: encara que afecten el potencial zeta i els resultats UV-Vis en diferents graus, els resultats mitjans Z no són coherents.Això indica que l'adsorció superficial de les molècules inhibeix la repulsió electrostàtica, però al mateix temps proporciona estabilitat dimensional.
Per tal d'enllaçar els resultats anteriors amb els resultats anteriors i simular les condicions biològiques amb més habilitat, vam seleccionar alguns dels components de cultiu cel·lular més utilitzats i els vam utilitzar com a condicions experimentals per estudiar l'estabilitat dels col·loides AgNP.En tot l'experiment in vitro, una de les funcions més importants del DMEM com a medi és establir les condicions osmòtiques necessàries, però des del punt de vista químic, es tracta d'una solució salina complexa amb una força iònica total semblant a 150 mM de NaCl. .40 Pel que fa al FBS, és una barreja complexa de biomolècules -principalment proteïnes- des del punt de vista de l'adsorció superficial, té algunes similituds amb els resultats experimentals de glucosa i glutamina, malgrat la composició química i la diversitat El sexe és molt més complicat.19 DLS i UV: els resultats visibles que es mostren a la figura 8 i la figura suplementària S5, respectivament, es poden explicar examinant la composició química d'aquests materials i correlacionant-los amb les mesures de la secció anterior.
Figura 8 Els resultats de la dispersió de la llum dinàmica de la mostra de nanopartícules de plata terminades amb citrats amb mida creixent (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II i 50 nm: AgNP-III) s'expressen com el diàmetre hidrodinàmic mitjà (Z mitjana). ) (dreta) En presència de components de cultiu cel·lular DMEM i FBS, el potencial zeta (esquerra) canvia en 24 hores.
La dilució d'AgNPs de diferents mides en DMEM té un efecte sobre l'estabilitat col·loïdal similar a l'observat en presència d'eleves concentracions de NaCl.La dispersió d'AgNP en 50 v/v% de DMEM va mostrar que es va detectar una agregació a gran escala amb l'augment del potencial zeta i el valor mitjà Z i la forta disminució de la intensitat SPR.Val la pena assenyalar que la mida màxima de l'agregat induïda per DMEM després de 24 hores és inversament proporcional a la mida de les nanopartícules d'imprimació.
La interacció entre FBS i AgNP és similar a la observada en presència de molècules més petites com la glucosa i la glutamina, però l'efecte és més fort.La mitjana Z de les partícules no es veu afectada, mentre que es detecta un augment del potencial zeta.El pic SPR va mostrar un lleuger desplaçament al vermell, però potser més interessant, la intensitat SPR no va disminuir tan significativament com a la mesura de control.Aquests resultats es poden explicar per l'adsorció innata de macromolècules a la superfície de les nanopartícules (fila inferior a la figura 4), que ara s'entén com la formació de corona biomolecular al cos.49