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Sò i nanoparticuli più chjuchi sempre megliu?Capisce l'effetti biologichi di l'agregazione dipendente da a dimensione di nanoparticelle d'argentu in cundizioni biologicamente pertinenti
Autori: Bélteky P, Rónavári A, Zakupszky D, Boka E, Igaz N, Szerencsés B, Pfeiffer I, Vágvölgyi C, Kiricsi M, Kónya Z
Péter Bélteky,1,* Andrea Rónavári,1,* Dalma Zakupszky,1 Eszter Boka,1 Nóra Igaz,2 Bettina Szerencsés,3 Ilona Pfeiffer,3 Csaba Vágvölgyi,3 Mónika Kiricsi di Chimica Ambientale, Ungheria, Ungheria Facultà di Scienze è Informatica Ungheria , Università di Szeged;2 Dipartimentu di Biochimica è Biologia Moleculare, Facultà di Scienze è Infurmazioni, Università di Szeged, Ungheria;3 Dipartimentu di Microbiologia, Facultà di Scienze è Infurmazioni, Università di Szeged, Ungheria;4MTA-SZTE Reaction Kinetics and Surface Chemistry Research Group, Szeged, Ungheria* Questi autori anu cuntribuitu ugualmente à stu travagliu.Comunicazione: Zoltán Kónya Dipartimentu di Chimica Applicata è Ambiente, Facultà di Scienze è Informatica, Università di Szeged, Rerrich Square 1, Szeged, H-6720, Ungheria Telefono +36 62 544620 Email [Prutezzione email] Scopu: Nanoparticule d'argentu (AgNPs) sò unu di i nanomateriali più studiati, soprattuttu per via di e so applicazioni biomedicali.Tuttavia, per via di l'agregazione di nanoparticelle, a so citotossicità eccellente è l'attività antibacteriana sò spessu cumprumessi in i media biologichi.In questu travagliu, u cumpurtamentu di l'aggregazione è l'attività biologica cunnessa di trè campioni di nanoparticule d'argentu terminati in citrate cù un diametru mediu di 10, 20 è 50 nm sò stati studiati.Metudu: Aduprate un microscopiu elettronicu di trasmissione per sintetizà è caratterizà e nanoparticelle, valutà u so cumpurtamentu di aggregazione à diversi valori di pH, NaCl, concentrazioni di glucose è glutamine per dispersione dinamica di luce è spettroscopia ultravioletta.Inoltre, in i cumpunenti di u mediu di cultura cellulare cum'è Dulbecco migliurà u cumpurtamentu di aggregazione in Eagle Medium è Fetal Calf Serum.Risultati: I risultati mostranu chì u pH acidicu è u cuntenutu di l'elettroliti fisiologichi induce generalmente l'agregazione di micron-scala, chì pò esse mediata da a furmazione di corona biomolecular.Hè da nutà chì e particelle più grande mostranu una resistenza più altu à l'influenzi esterni cà i so contraparti più chjuchi.I testi di citotossicità in vitro è antibacterial sò stati realizati trattendu e cellule cù aggregati di nanoparticule in diverse tappe di aggregazione.Conclusioni: I nostri risultati revelanu una correlazione prufonda trà a stabilità colloidale è a tossicità di AgNPs, postu chì l'agregazione estrema porta à a perdita completa di l'attività biologica.U più altu gradu di anti-agregazione osservatu per particelle più grande hà un impattu significativu nantu à a toxicità in vitro, perchè tali campioni conservanu più attività antimicrobiana è cellula di mammiferi.Queste scuperte portanu à a cunclusione chì, malgradu l'opinione generale in a literatura pertinenti, mira à i più chjuchi nanoparticuli pussibuli ùn pò micca esse u megliu cursu d'azzione.Parole chjave: crescita mediata da sementi, stabilità colloidale, cumportamentu di aggregazione dipendente da a dimensione, tossicità di dannu di aggregazione
Cume a dumanda è a pruduzzione di nanomateriali cuntinueghjanu à aumentà, più è più attente hè pagata à a so biosafety o attività biologica.Nanoparticles d'argentu (AgNPs) sò unu di i rapprisentanti più cumunimenti sintetizzati, ricercati è utilizati di sta classa di materiali per via di e so eccellenti proprietà catalitiche, ottiche è biologiche.1 Hè generalmente crede chì e caratteristiche uniche di i nanomateriali (inclusi AgNPs) sò principalmente attribuiti à a so grande superficie specifica.Per quessa, u prublema inevitabbilmente hè ogni prucessu chì affetta sta funzione chjave, cum'è a dimensione di particella, u revestimentu di a superficia O l'aggregazione, s'ellu hà da danni severu e proprietà di nanoparticulate chì sò critichi per applicazioni specifiche.
L'effetti di a dimensione di particella è stabilizatori sò sughjetti chì sò stati relativamente ben documentati in a literatura.Per esempiu, a vista generalmente accettata hè chì i nanoparticuli più chjuchi sò più tossichi cà i nanoparticuli più grande.2 In cunfurmità cù a literatura generale, i nostri studii precedenti anu dimustratu l'attività dipendente da a dimensione di nanoargentu nantu à e cellule di mammiferi è i microorganismi.3- 5 U revestimentu di a superficia hè un altru attributu chì hà una larga influenza nantu à e proprietà di i nanomateriali.Solu aghjustendu o mudificà stabilizzatori nantu à a so superficia, u listessu nanomateriale pò avè proprietà fisiche, chimiche è biologiche completamente diverse.L'applicazione di l'agenti di capping hè più spessu realizata cum'è parte di a sintesi di nanoparticule.Per esempiu, i nanoparticuli d'argentu terminati in citrate sò unu di l'AgNP più pertinenti in a ricerca, chì sò sintetizzati per riduzzione di sali d'argentu in una suluzione stabilizzatrice selezziunata cum'è u mediu di reazione.6 Citrate pò facilmente prufittà di u so prezzu bassu, a dispunibilità, a biocompatibilità è a forte affinità per l'argentu, chì pò esse riflessu in diverse interazzioni pruposti, da l'adsorzione di superficia reversibile à l'interazzione ionica.Picculi molécule è ioni poliatomichi vicinu à 7,8, cum'è citrati, polimeri, polielettroliti è agenti biologichi sò ancu cumunimenti usati per stabilizzà nano-argentu è eseguisce funziunalità unichi nantu à questu.9-12
Ancu s'è a pussibilità di alterà l'attività di nanoparticule per capping intenzionale di a superficia hè una zona assai interessante, u rolu principali di stu revestimentu di a superficia hè insignificante, chì furnisce stabilità coloidale per u sistema di nanoparticule.A grande superficie specifica di i nanomateriali pruducerà una grande energia di superficia, chì impedisce a capacità termodinamica di u sistema per ghjunghje à a so energia minima.13 Senza una stabilizazione propria, questu pò purtà à l'agglomerazione di nanomateriali.L'aggregazione hè a furmazione di aggregati di particelle di diverse forme è dimensioni chì si trovanu quandu e particelle disperse si scontranu è l'interazzione termodinamica attuale permettenu à e particelle di aderisce l'una à l'altru.Per quessa, i stabilizatori sò usati per prevene l'aggregazione intruducendu una forza repulsiva abbastanza grande trà e particelle per contru à a so attrazione termodinamica.14
Ancu s'è u sughjettu di a dimensione di particella è a cobertura di a superficia hè stata scuperta in u cuntestu di a so regulazione di l'attività biologica attivata da nanoparticule, l'aggregazione di particelle hè una zona largamente trascurata.Ùn ci hè guasi un studiu approfonditu per risolve a stabilità coloidale di nanoparticule in cundizioni biologicamente pertinenti.10,15-17 Inoltre, sta cuntribuzione hè particularmente rara, induve a toxicità assuciata à l'agregazione hè stata ancu studiata, ancu s'ellu pò causà reazzioni avversi, cum'è trombosi vascular, o perdita di e caratteristiche desiderate, cum'è a so toxicità, cum'è mostra in Figura 1.18, 19 mostratu.In fatti, unu di i pochi miccanismi cunnisciuti di resistenza nanoparticulate d'argentu hè liata à l'aggregazione, perchè certi ceppi di E. coli è Pseudomonas aeruginosa sò signalati per riduce a so sensibilità nano-argentu spressione u flagellin di a proteina, flagellin.Hà una alta affinità per l'argentu, inducendu cusì l'agregazione.20
Ci hè parechje miccanismi diffirenti ligati à a toxicità di nanoparticule d'argentu, è l'aggregazione afecta à tutti questi miccanismi.U metudu più discutitu di l'attività biologica di l'AgNP, qualchì volta chjamatu u mecanismu di "Cavallu di Troia", cunsidereghja AgNP cum'è trasportatori Ag +.1,21 U mecanismu di u cavallu di Troia pò assicurà un grande aumentu di a cuncentrazione Ag + lucale, chì porta à a generazione di ROS è a depolarizazione di a membrana.22-24 L'aggregazione pò influenzà a liberazione di Ag+, affettendu cusì a toxicità, perchè riduce a superficia attiva efficace induve i ioni d'argentu ponu esse oxidati è dissoluti.Tuttavia, AgNPs ùn mostranu micca solu toxicità per a liberazione di ioni.Molte interazzioni di dimensione è morfologia deve esse cunsiderate.Frà elli, a dimensione è a forma di a superficia di nanoparticule sò e caratteristiche di definizione.4,25 A cullizzioni di sti miccanismi pò esse categurizatu cum'è "meccanismi di toxicità indotta".Ci hè potenzalmentu assai reazzioni di a membrana mitocondriale è di a superficia chì ponu dannà l'organuli è causanu a morte cellulare.25-27 Siccomu a furmazione di aggregati naturalmente affetta a dimensione è a forma di l'ogetti chì cuntenenu argentu ricunnisciuti da i sistemi viventi, sti interazzione ponu ancu esse affettati.
In u nostru documentu precedente nantu à l'aggregazione di nanoparticelle d'argentu, avemu dimustratu una prucedura di screening efficae cumpostu di esperimenti biologichi chimichi è in vitro per studià stu prublema.19 Dynamic Light Scattering (DLS) hè a tecnica preferita per questi tipi d'ispezioni perchè u materiale pò sparghje fotoni à una lunghezza d'onda paragunabile à a dimensione di e so particelle.Siccomu a velocità di u muvimentu Brownian di particeddi in u mediu liquidu hè ligata à a dimensione, u cambiamentu in l'intensità di a luce spargugliata pò esse usatu per determinà u diametru idrodinamicu mediu (Z-mean) di a mostra di liquidu.28 Inoltre, applicà una tensione à l'esemplariu, u potenziale zeta (potenziale ζ) di a nanoparticella pò esse misurata in modu simile à u valore mediu Z.13,28 Se u valore assolutu di u potenziale zeta hè abbastanza altu (sicondu a guida generale> ± 30 mV), generà una forte repulsione elettrostatica trà e particelle per contru à l'agregazione.A risonanza di plasmoni di superficia caratteristica (SPR) hè un fenomenu otticu unicu, principalmente attribuitu à nanoparticelle di metalli preziosi (principalmente Au è Ag).29​​ Basatu nantu à l'oscillazioni elettroniche (plasmoni di superficia) di sti materiali à a nanoscala, hè cunnisciutu chì l'AgNP sferichi anu un piccu d'assorbimentu UV-Vis caratteristicu vicinu à 400 nm.30 L'intensità è a variazione di a lunghezza d'onda di e particelle sò aduprate per supplementà i risultati DLS, postu chì stu metudu pò esse usatu per detectà l'aggregazione di nanoparticule è l'adsorption superficiale di biomolecule.
Basatu nantu à l'infurmazioni ottenute, a viabilità cellulare (MTT) è l'analisi antibacteriali sò realizati in una manera chì a toxicità AgNP hè descritta cum'è una funzione di u nivellu di aggregazione, invece di (u fattore più comunmente utilizatu) a cuncentrazione di nanoparticule.Stu metudu unicu ci permette di dimustrà l'impurtanza prufonda di u livellu di aggregazione in l'attività biologica, perchè, per esempiu, AgNPs terminati da citrate perdennu cumplettamente a so attività biologica in poche ore per via di l'aggregazione.19
In u travagliu attuale, avemu u scopu di espansione assai i nostri cuntributi precedenti in a stabilità di i colloidi bio-relativi è u so impattu nantu à l'attività biologica studiendu l'effettu di a dimensione di nanoparticule nantu à l'aggregazione di nanoparticule.Questu hè senza dubbitu unu di i studii di nanoparticles.Una prospettiva di più altu prufilu è 31 Per investigà stu prublema, un metudu di crescita mediata da a semente hè stata utilizata per pruduce AgNPs terminati da citrate in trè intervalli di dimensioni diverse (10, 20 è 50 nm).6,32 cum'è unu di i metudi più cumuni.Per i nanomateriali chì sò largamente è rutinariamente usati in l'applicazioni mediche, AgNPs terminati da citrate di diverse dimensioni sò scelti per studià a dipendenza di dimensioni pussibuli di e proprietà biologiche di l'aggregazione di nanosilver.Dopu avè sintetizatu AgNPs di diverse dimensioni, avemu carattarizatu i campioni pruduciuti per microscopia elettronica di trasmissione (TEM), è dopu esaminatu e particelle utilizendu a prucedura di screening sopra citata.Inoltre, in presenza di culturi di cellule in vitro, u Mediu di l'Aigle Modificatu di Dulbecco (DMEM) è u Serum Bovinu Fetale (FBS), u cumpurtamentu di aggregazione dipendente da a dimensione è u so cumpurtamentu sò stati valutati à diversi valori di pH, NaCl, glucose è concentrazioni di glutamine.E caratteristiche di a citotossicità sò determinate in cundizioni cumplessi.U cunsensu scientificu indica chì in generale, i particeddi più chjuchi sò preferiti;a nostra investigazione furnisce una piattaforma chimica è biologica per stabilisce se questu hè u casu.
Trè nanoparticule d'argentu cù diverse variazioni di grandezza sò stati preparati da u metudu di crescita mediata da a sumente pruposta da Wan et al., cù ligeri ajustamenti.6 Stu metudu hè basatu annantu à a riduzzione chimica, utilizendu nitratu d'argentu (AgNO3) cum'è fonte d'argentu, borohydrure di sodiu (NaBH4) cum'è agenti riducente, è citratu di sodiu cum'è stabilizzante.Prima, preparate 75 mL di soluzione acquosa di citrate 9 mM da citrate di sodium dihydrate (Na3C6H5O7 x 2H2O) è calore à 70 ° C.Dopu, 2 mL di suluzione 1% p/v AgNO3 sò stati aghjuntu à u mediu di reazione, è dopu a suluzione di borohydrure di sodiu appena preparata (2 mL 0,1% p/v) hè stata versata in a mistura goccia.A sospensjoni gialla-marrone resultante hè stata mantinuta à 70 ° C cù agitazione vigorosa per 1 ora, è dopu rinfriscata à a temperatura di l'ambienti.U sample resultante (riferitu cum'è AgNP-I da avà) hè utilizatu com'è a basa per a crescita mediata da a semente in u prossimu passu di sintesi.
Per sintetizà una sospensione di particelle di medie dimensioni (indicata cum'è AgNP-II), riscalda 90 mL di soluzione di citrate 7,6 mM à 80 ° C, mischjala cù 10 mL AgNP-I, è poi mischjà 2 mL 1% p/v A suluzione AgNO3. Hè stata mantinuta sottu una vigorosa agitazione meccanica per 1 ora, è dopu a mostra hè stata rinfriscata à a temperatura di l'ambienti.
Per a particella più grande (AgNP-III), repite u stessu prucessu di crescita, ma in questu casu, utilizate 10 mL di AgNP-II cum'è a sospensjoni di sementi.Dopu chì i campioni righjunghjinu a temperatura di l'ambienti, stabiliscenu a so cuncentrazione nominale di Ag in basa di u cuntenutu tutale di AgNO3 à 150 ppm aghjustendu o evaporendu un solvente addiziale à 40 ° C, è infine i conservanu à 4 ° C finu à l'utilizazione.
Aduprate FEI Tecnai G2 20 X-Twin Transmission Electron Microscope (TEM) (FEI Corporate Headquarters, Hillsboro, Oregon, USA) cù una tensione di accelerazione 200 kV per esaminà e caratteristiche morfologiche di nanoparticelle è catturà u so mudellu di diffrazione di elettroni (ED).Almenu 15 immagini rappresentative (~ 750 particelle) sò state valutate cù u pacchettu di software ImageJ, è l'istogrammi risultanti (è tutti i grafici in tuttu u studiu) sò stati creati in OriginPro 2018 (OriginLab, Northampton, MA, USA) 33, 34.
U diametru idrodinamicu mediu (Z-media), u potenziale zeta (ζ-potenziale) è a risonanza di plasmoni di a superficia caratteristica (SPR) di i campioni sò stati misurati per illustrà e so proprietà colloidali iniziali.U diametru idrodinamicu mediu è u potenziale zeta di a mostra sò stati misurati da l'instrumentu Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK) utilizendu cellule capillari piegate dispunibuli à 37±0.1 ° C.U spettrofotometru UV-Vis di Ocean Optics 355 DH-2000-BAL (Halma PLC, Largo, FL, USA) hè stata utilizata per ottene caratteristiche SPR caratteristiche da u spettru di assorbimentu UV-Vis di campioni in a gamma di 250-800 nm.
Duranti tuttu l'esperimentu, trè tippi di misurazione diffirenti in relazione à a stabilità coloidale sò stati realizati à u stessu tempu.Aduprate DLS per misurà u diametru idrodinamicu mediu (media Z) è u potenziale zeta (potenziale ζ) di e particelle, perchè a media Z hè ligata à a dimensione media di l'aggregati di nanoparticule, è u putenziale zeta indica se a repulsione elettrostatica in u sistema. hè abbastanza forte per compensà l'attrazione di Van der Waals trà nanoparticelle.E misurazioni sò fatte in triplicate, è a deviazione standard di Z media è u potenziale zeta hè calculata da u software Zetasizer.I spettri SPR caratteristici di e particelle sò valutati da spettroscopia UV-Vis, perchè i cambiamenti in l'intensità massima è a lunghezza d'onda ponu indicà l'aggregazione è l'interazzione di a superficia.29,35 In fattu, a risonanza di plasmoni di a superficia in metalli preziosi hè cusì influente chì hà purtatu à novi metudi di analisi di biomolecule.29,36,37 A cuncentrazione di AgNPs in a mistura sperimentale hè di circa 10 ppm, è u scopu hè di stabilisce l'intensità di l'absorzione SPR iniziale massima à 1. L'esperimentu hè statu realizatu in modu dipendente di u tempu à 0;1,5;3;6;12 è 24 ore in diverse cundizioni biologicamente pertinenti.Più dettagli chì descrizanu l'esperimentu ponu esse vistu in u nostru travagliu precedente.19 In breve, diversi valori di pH (3; 5; 7,2 è 9), diverse concentrazioni di cloruro di sodiu (10 mM; 50 mM; 150 mM), glucose (3,9 mM; 6,7 mM) è glutamine (4 mM), è hà ancu preparatu Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) è Fetal Bovine Serum (FBS) (in l'acqua è DMEM) cum'è sistemi di mudelli, è hà studiatu i so effetti nantu à u cumpurtamentu di l'aggregazione di i nanoparticuli d'argentu sintetizzati.pH I valori di NaCl, glucose è glutamine sò valutati in basa di cuncentrazione fisiologica, mentre chì e quantità di DMEM è FBS sò listessi à i livelli utilizati in tuttu l'esperimentu in vitro.38-42 Tutte e misurazioni sò state eseguite à pH 7,2 è 37 ° C cù una cuncentrazione di sali di fondo constante di 10 mM NaCl per eliminà qualsiasi interazzione di particelle à longa distanza (eccettu per certi esperimenti di pH è NaCl, induve questi attributi sò e variàbili sottu). studiu).28 A lista di e diverse cundizioni hè riassuntu in a Table 1. L'esperimentu marcatu cù † hè utilizatu com'è riferimentu è currisponde à una mostra chì cuntene 10 mM NaCl è pH 7,2.
A linea cellulare di u cancer di prostata umana (DU145) è i keratinociti umani immortalizzati (HaCaT) sò stati ottenuti da ATCC (Manassas, VA, USA).Le cellule sono regolarmente coltivate nel mezzo essenziale minimo Eagle (DMEM) di Dulbecco contenente 4,5 g/L di glucosio (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), supplementato con 10% FBS, 2 mM L-glutammina, 0,01% Streptomicina e 0,005% Penicillin (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA).E cellule sò cultivate in un incubatore à 37 ° C sottu 5% CO2 è 95% umidità.
Per spiegà i cambiamenti in a citotossicità AgNP causati da l'aggregazione di particelle in modu dipendente di u tempu, hè statu realizatu un test MTT in dui passi.Prima, a viabilità di i dui tipi di cellule hè stata misurata dopu u trattamentu cù AgNP-I, AgNP-II è AgNP-III.À questu scopu, i dui tipi di celluli sò stati seminati in platti di 96 pozzi à una densità di 10 000 cellule / pozzu è trattati cù trè dimensioni diverse di nanoparticule d'argentu in cuncentrazione crescente in u sicondu ghjornu.Dopu à 24 ore di trattamentu, e cellule sò lavate cù PBS è incubate cù 0,5 mg / mL di reagent MTT (SERVA, Heidelberg, Germania) diluitu in un mediu di cultura per 1 ora à 37 ° C.I cristalli di Formazan sò stati dissolti in DMSO (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), è l'assorbimentu hè statu misuratu à 570 nm cù un lettore di piastra Synergy HTX (BioTek-Hungary, Budapest, Ungheria).U valore di l'absorzione di a mostra di cuntrollu micca trattatu hè cunsideratu cum'è una rata di sopravvivenza di 100%.Eseguite almenu 3 esperimenti cù quattru replicati biologichi indipendenti.L'IC50 hè calculatu da una curva di risposta di dosa basatu nantu à i risultati di vitalità.
Dopu, in u sicondu passu, incubate e particelle cù 150 mM NaCl per periodi di tempu differenti (0, 1,5, 3, 6, 12 è 24 ore) prima di u trattamentu di e cellule, sò stati pruduciuti diversi stati di aggregazione di nanoparticule d'argentu.In seguitu, u listessu test MTT hè statu realizatu cum'è descrittu prima per valutà i cambiamenti in a viabilità cellulare affettata da l'aggregazione di particelle.Aduprate GraphPad Prism 7 per valutà u risultatu finali, calculate a significazione statistica di l'esperimentu per un test t non appaiatu, è marcate u so livellu cum'è * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01), *** (p ≤ 0,001). ) È **** (p ≤ 0,0001).
Tre diverse dimensioni di nanoparticelle d'argentu (AgNP-I, AgNP-II è AgNP-III) sò state aduprate per a suscettibilità antibatterica à Cryptococcus neoformans IFM 5844 (IFM; Centru di Ricerca per Fungi Patogeni è Tossicologia Microbia, Università di Chiba) è Bacillus Test megaterium SZMC 60311. (SZMC: Szeged Microbiology Collection) è E. coli SZMC 0582 in RPMI 1640 medium (Sigma-Aldrich Co.).Per evaluà i cambiamenti in l'attività antibacteriale causati da l'agregazione di particeddi, prima, a so cuncentrazione minima inhibitoria (MIC) hè stata determinata da a microdilution in un microtiter plate 96-well.À 50 μL di sospensione di cellule standardizzate (5 × 104 cellule / mL in RPMI 1640 medium), aghjunghje 50 μL di sospensione di nanoparticule d'argentu è dilute in serie duie volte a cuncentrazione (in u mediu sopra menzionatu, a gamma hè 0 è 75 ppm, Vale à dì, l'échantillon de contrôle contient 50 μL de suspension cellulaire et 50 μL de milieu sans nanoparticules).Dopu, a piastra hè stata incubata à 30 ° C per 48 ore, è a densità ottica di a cultura hè stata misurata à 620 nm cù un lettore di piastre SPECTROstar Nano (BMG LabTech, Offenburg, Germania).L'esperimentu hè statu fattu trè volte in triplicate.
Eccettu chì 50 μL di campioni di nanoparticule aggregate singuli sò stati utilizati à questu tempu, a listessa prucedura cum'è descritta prima hè stata aduprata per esaminà l'effettu di l'aggregazione nantu à l'attività antibacteriale nantu à i ceppi citati.Diversi stati di aggregazione di nanoparticelle d'argentu sò prudutte da incubazione di e particelle cù 150 mM NaCl per periodi differenti di tempu (0, 1,5, 3, 6, 12 è 24 ore) prima di trasfurmazioni cellula.Una sospensjoni supplementata cù 50 μL di mediu RPMI 1640 hè stata aduprata cum'è un cuntrollu di crescita, mentre chì per cuntrullà a toxicità, hè stata aduprata una sospensione cù nanoparticule non aggregate.L'esperimentu hè statu fattu trè volte in triplicate.Aduprate GraphPad Prism 7 per evaluà u risultatu finali di novu, utilizendu a stessa analisi statistica cum'è l'analisi MTT.
U nivellu di aggregazione di e particeddi più chjuchi (AgNP-I) hè statu carattarizatu, è i risultati sò stati parzialmente publicati in u nostru travagliu precedente, ma per un megliu paraguni, tutti i particeddi sò stati schermati bè.I dati spirimintali sò culligati è discututi in e seguenti sezzioni.Tre dimensioni di AgNP.19
E misurazioni eseguite da TEM, UV-Vis è DLS anu verificatu a sintesi riescita di tutti i campioni AgNP (Figura 2A-D).Sicondu a prima fila di Figura 2, a particella più chjuca (AgNP-I) mostra una morfologia sferica uniforme cù un diametru mediu di circa 10 nm.U metudu di crescita mediata da a semente furnisce ancu AgNP-II è AgNP-III cù diversi intervalli di dimensioni cù diametri di particella media di circa 20 nm è 50 nm, rispettivamente.Sicondu a deviazione standard di a distribuzione di particelle, e dimensioni di i trè campioni ùn si superponu micca, chì hè impurtante per a so analisi comparativa.Paragunendu u rapportu d'aspettu mediu è u rapportu di magrezza di e proiezioni 2D di particelle basate in TEM, si assume chì a sfericità di e particelle hè valutata da u plug-in di filtru di forma di ImageJ (Figura 2E).43 Sicondu l'analisi di a forma di particeddi, u so rapportu d'aspettu (latu grande / latu curtu di u più chjucu rettangulu di limitazione) ùn hè micca affettatu da a crescita di particelle, è a so ratio di magrezza (area misurata di u circondu perfettu currispundente / area teorica). ) diminuisce gradualmente.Questu risultatu in più è più particelle poliedriche, chì sò perfettamente tondi in teoria, currisponde à un rapportu di magrezza di 1.
Figura 2 Image di microscopiu elettronicu di trasmissione (TEM) (A), mudellu di diffrazione di elettroni (ED) (B), istogramma di distribuzione di dimensione (C), spettru d'assorbimentu di luce ultraviolet-visibile (UV-Vis) caratteristicu (D), è citratu fluidu mediu. Nanoparticule d'argentu terminate cù diametru meccanicu (Z-media), potenziale zeta, rapportu d'aspettu è rapportu di spessore (E) anu trè intervalli di dimensioni diverse: AgNP-I hè 10 nm (fila superiore), AgNP -II hè 20 nm (fila media). ), AgNP-III (fila in basso) è 50 nm.
Ancu se a natura ciclica di u metudu di crescita hà affettatu a forma di particella in una certa misura, risultatu in a sfericità più chjuca di AgNP più grande, tutti i trè campioni restanu quasi-sferichi.Inoltre, cum'è mostra in u mudellu di diffrazione di l'elettroni in Figura 2B, nano A cristalinità di e particelle ùn hè micca affettata.L'anellu di diffrazione prominente - chì pò esse correlatu cù l'indici di Miller (111), (220), (200) è (311) di l'argentu - hè assai coherente cù a literatura scientifica è i nostri cuntributi previ.9, 19,44 A frammentazione di l'anellu di Debye-Scherrer di AgNP-II è AgNP-III hè duvuta à u fattu chì l'imaghjini ED hè catturata à u stessu ingrandimentu, cusì chì a dimensione di particella aumenta, u numeru di particeddi diffratti per ogni. L'area di unità aumenta è diminuisce.
A dimensione è a forma di nanoparticuli sò cunnisciuti per affettà l'attività biologica.3,45 L'attività catalitica è biologica dipendente da a forma pò esse spiegata da u fattu chì e diverse forme tendenu à proliferate certe facce di cristalli (avè diversi indici di Miller), è queste facci di cristalli anu diverse attività.45,46 Siccomu i particeddi preparati furniscenu risultati ED simili chì currispondenu à caratteristiche di cristalli assai simili, si pò assume chì in i nostri successivi esperimenti di stabilità colloidale è attività biologica, ogni differenza osservata deve esse attribuita à a dimensione di Nanoparticle, micca à e proprietà di forma.
I risultati UV-Vis riassunti in a Figura 2D enfatizzanu ancu a natura sferica eccessiva di l'AgNP sintetizatu, perchè i picchi SPR di tutti i trè campioni sò intornu à 400 nm, chì hè un valore caratteristicu di nanoparticule d'argentu sferiche.29,30 I spettri catturati anu cunfirmatu ancu u successu di crescita mediata da a sumente di nanoargentu.Cume a dimensione di particella aumenta, a lunghezza d'onda currisponde à l'assorbimentu luminoso massimu di AgNP-II-più prominente-Secunnu a literatura, AgNP-III hà sperimentatu un redshift.6,29
In quantu à a stabilità coloidale iniziale di u sistema AgNP, DLS hè stata utilizata per misurà u diametru idrodinamicu mediu è u potenziale zeta di e particelle à pH 7,2.I risultati illustrati in a Figura 2E mostranu chì AgNP-III hà una stabilità colloidale più altu ch'è AgNP-I o AgNP-II, perchè e linee guida cumuni indicanu chì un potenziale zeta di 30 mV assolutu hè necessariu per a stabilità colloidale à longu andà. u valore mediu Z (ottenutu cum'è u diametru idrodinamicu mediu di particeddi liberi è aggregati) hè paragunatu cù a dimensione di particella primaria ottenuta da TEM, perchè più vicinu sò i dui valori, u più mite u gradu Gather in a mostra.In fattu, a media Z di AgNP-I è AgNP-II hè ragiunate più altu ch'è a so dimensione di particella principale evaluata da TEM, cusì paragunatu cù AgNP-III, sti campioni sò previsti per esse più probabili di aggregate, induve u potenziale zeta altamente negativu. hè accumpagnatu da una taglia stretta U valore mediu Z.
A spiegazione di stu fenomenu pò esse duie volte.Da una banda, a cuncentrazione di citrate hè mantinuta à un livellu simile in tutti i passi di sintesi, chì furnisce una quantità relativamente alta di gruppi di superficia carica per impedisce a superficia specifica di e particelle in crescita di diminuite.In ogni casu, secondu Levak et al., molécule chjuche cum'è citrate ponu esse facilmente scambiate da biomolecule nantu à a superficia di i nanoparticuli.In questu casu, a stabilità coloidale serà determinata da a corona di e biomolecule prodotte.31 Perchè stu cumpurtamentu hè statu ancu osservatu in e nostre misurazioni di aggregazione (discussu in più dettagliu dopu), u capping di citrate solu ùn pò micca spiegà stu fenomenu.
Per d 'altra banda, a dimensione di particella hè inversamente proporzionale à a tendenza di aggregazione à u livellu nanometru.Questu hè soprattuttu sustinutu da u metudu tradiziunale Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO), induve l'attrazione di particella hè descritta cum'è a summa di e forze attrattivi è repulsive trà e particelle.Sicondu He et al., u valore massimu di a curva d'energia DLVO diminuisce cù a dimensione di i nanoparticuli in i nanoparticuli di hematite, facenu più faciule per ghjunghje à l'energia primaria minima, favurendu cusì l'aggregazione irreversibile (condensazione).47 Tuttavia, hè speculatu chì ci sò altri aspetti oltre e limitazioni di a teoria DLVO.Ancu se a gravità di van der Waals è a repulsione elettrostatica di doppia strata sò simili cù l'aumentu di a dimensione di particella, una rivista di Hotze et al.prupone chì hà un effettu più forte nantu à l'agregazione chì DLVO permette.14 Crèdenu chì a curvatura di a superficia di i nanoparticuli ùn pò più esse stimata cum'è una superficia plana, facendu l'estimazione matematica inapplicabile.Inoltre, cum'è a dimensione di particella diminuite, u percentuale di l'atomi prisenti nantu à a superficia diventa più altu, purtendu à a struttura elettronica è u cumpurtamentu di a carica di a superficia.È cambia a reattività di a superficia, chì pò purtà à una diminuzione di a carica in a doppia capa elettrica è prumove l'aggregazione.
Quandu si comparanu i risultati DLS di AgNP-I, AgNP-II è AgNP-III in a Figura 3, avemu osservatu chì tutti i trè campioni mostravanu un pH simile chì incitava l'aggregazione.Un ambiente assai acidicu (pH 3) cambia u potenziale zeta di a mostra à 0 mV, pruvucannu chì e particelle formanu aggregati micron-sized, mentre chì u pH alkaline cambia u so potenziale zeta à un valore negativu più grande, induve e particelle formanu aggregati più chjuchi (pH 5). ).È 7.2) ), o restanu cumplettamente senza aggregazione (pH 9).Alcune differenze impurtanti trà i diversi campioni sò stati ancu osservati.In tuttu l'esperimentu, AgNP-I s'hè dimustratu per esse u più sensibile à i cambiamenti di u potenziale zeta indottu da u pH, perchè u potenziale zeta di queste particelle hè statu riduttu à pH 7,2 cumparatu à pH 9, mentri AgNP-II è AgNP-III solu mostrava A. cambiamentu considerableu in ζ hè intornu à pH 3. In più, AgNP-II hà dimustratu cambiamenti più lenti è u putenziale zeta moderatu, mentri AgNP-III hà dimustratu u cumpurtamentu mildest di i trè, perchè u sistema hà dimustratu u più altu valore zeta assolutu è u muvimentu di tendenza lenta, chì indicanu AgNP-III A più resistente à l'aggregazione indotta da pH.Questi risultati sò cunsistenti cù i risultati di misurazione di diametru idrodinamicu mediu.Considérant la taille des particules de leurs amorces, l'AgNP-I a montré une agrégation constante et graduelle à tous les pH, très probablement à cause du fond de NaCl 10 mM, tandis que l'AgNP-II et l'AgNP-III n'ont montré de manière significative qu'à pH 3 de collecte.A diferenza più interessante hè chì, malgradu a so grande dimensione di nanoparticule, AgNP-III forma l'aggregati più chjuchi à pH 3 in 24 ore, mette in risaltu e so proprietà anti-aggregazione.Dividendu u Z mediu di AgNPs à pH 3 dopu à 24 ore per u valore di l'esemplariu preparatu, pò esse osservatu chì e dimensioni aggregate relative di AgNP-I è AgNP-II anu aumentatu da 50 volte, 42 volte è 22 volte. , rispettivamente.III.
Figura 3 I risultati di scattering di luce dinamica di l'esemplari di nanoparticule d'argentu terminati in citrate cù una dimensione crescente (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II è 50 nm: AgNP-III) sò espressi cum'è u diametru idrodinamicu mediu (Z media). ) (diritta) In diverse cundizioni di pH, u potenziale zeta (a manca) cambia in 24 ore.
L'aggregazione osservata dipendente da u pH hà ancu affettatu a risonanza di plasmoni di a superficie caratteristica (SPR) di i campioni AgNP, cum'è evidenza da i so spettri UV-Vis.Sicondu a Figura Supplementaria S1, l'aggregazione di tutte e trè sospensioni di nanoparticule d'argentu hè seguita da una riduzione di l'intensità di i so picchi SPR è da un cambiamentu rossu moderatu.L'estensione di sti cambiamenti in funzione di u pH hè coherente cù u gradu di aggregazione previstu da i risultati DLS, in ogni modu, alcune tendenzi interessanti sò stati osservati.Contrariamente à l'intuizione, risulta chì l'AgNP-II di grandezza media hè u più sensible à i cambiamenti SPR, mentri l'altri dui campioni sò menu sensibili.In a ricerca SPR, 50 nm hè u limitu teoricu di a dimensione di particella, chì hè utilizatu per distingue e particelle basate nantu à e so proprietà dielettriche.I particeddi più chjuchi di 50 nm (AgNP-I è AgNP-II) ponu esse discrittu cum'è dipoli dielettrichi simplici, mentre chì e particelle chì righjunghjenu o superanu stu limitu (AgNP-III) anu proprietà dielettriche più cumplesse, è a so risonanza A banda si divide in cambiamenti multimodali. .In u casu di dui campioni di particelle più chjuche, AgNP ponu esse cunsiderate cum'è dipoli simplici, è u plasma pò facilmente sovrappone.Quandu a dimensione di particella aumenta, stu accoppiamentu produce essenzialmente un plasma più grande, chì pò spiegà a sensibilità più alta osservata.29 Tuttavia, per i particeddi più grandi, l'estimazione di dipolu simplice ùn hè micca valida quandu altri stati d'accoppiamentu ponu ancu accade, chì ponu spiegà a tendenza diminuita di AgNP-III per indicà cambiamenti spettrali.29
In i nostri cundizioni spirimintali, hè dimustratu chì u valore di pH hà un effettu prufondu nantu à a stabilità coloidale di nanoparticelle d'argentu rivestite di citrate di diverse dimensioni.In questi sistemi, a stabilità hè furnita da i gruppi -COO- caricati negativamente nantu à a superficia di AgNPs.U gruppu funziunale carboxylate di l'ioni di citrate hè protonatu in un gran numaru di ioni H +, perchè u gruppu carboxyl generatu ùn pò più furnisce repulsione elettrostatica trà e particeddi, cum'è mostra in a fila superiore di Figura 4. Sicondu u principiu di Le Chatelier, AgNP. i campioni s'aggreganu rapidamente à pH 3, ma diventanu gradualmente più è più stabile cum'è u pH aumenta.
Figura 4 Meccanisimu schematicu di l'interazzione di a superficia definitu da l'aggregazione sottu diversi pH (fila superiore), concentrazione di NaCl (fila media) è biomolecole (fila in fondu).
Sicondu a Figura 5, a stabilità coloidale in suspensioni AgNP di diverse dimensioni hè stata ancu esaminata sottu cuncentrazione di sali crescente.Basatu nantu à u potenziale zeta, a dimensione di nanoparticula aumentata in questi sistemi AgNP terminati da citrate furnisce dinò una resistenza rinfurzata à influenze esterne da NaCl.In AgNP-I, 10 mM NaCl hè abbastanza per induce aggregazione ligera, è una cuncentrazione di sali di 50 mM furnisce risultati assai simili.In AgNP-II è AgNP-III, 10 mM NaCl ùn influenza micca significativamente u potenziale zeta perchè i so valori restanu à (AgNP-II) o sottu (AgNP-III) -30 mV.Aumentà a cuncentrazione di NaCl à 50 mM è infine à 150 mM NaCl hè abbastanza per riduce significativamente u valore assolutu di u potenziale zeta in tutti i campioni, anche se i particeddi più grossi conservanu più carica negativa.Questi risultati sò cunsistenti cù u diametru idrodinamicu mediu previstu di AgNPs;e linee di tendenza media di Z misurate nantu à 10, 50 è 150 mM NaCl mostranu valori diffirenti, gradualmenti crescente.Infine, aggregati micron-sized sò stati rilevati in tutti i trè esperimenti 150 mM.
Figura 5 I risultati di scattering di luce dinamica di l'esemplari di nanoparticule d'argentu terminati in citrate cù una dimensione crescente (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II è 50 nm: AgNP-III) sò espressi cum'è u diametru idrodinamicu mediu (Z media). ) (a diritta) è u potenziale zeta (a manca) cambianu in 24 ore sottu diverse concentrazioni di NaCl.
I risultati UV-Vis in a Figura Supplementaria S2 mostranu chì l'SPR di 50 è 150 mM NaCl in tutti i trè campioni hà una diminuzione istantanea è significativa.Questu pò esse spiegatu da DLS, perchè l'agregazione basata in NaCl si trova più veloce di l'esperimenti dipendente di u pH, chì hè spiegatu da a grande diferenza trà e misure iniziali (0, 1,5 è 3 ore).Inoltre, l'aumentu di a cuncentrazione di u sali aumenterà ancu a permistività relative di u mediu sperimentale, chì avarà un effettu prufondu nantu à a resonanza di plasmon superficia.29
L'effettu di NaCl hè riassuntu in a fila media di a Figura 4. In generale, pò esse cunclusu chì l'aumentu di a cuncintrazione di clorur di sodiu hà un effettu simili à l'aumentu di l'acidità, perchè l'ioni Na + anu una tendenza à coordenate intornu à i gruppi di carboxylate. suppressione di u potenziale zeta negativu AgNP.Inoltre, 150 mM NaCl pruducia aggregati micron-sized in tutti i trè campioni, chì indicanu chì a concentrazione fisiologica di l'elettroliti hè preghjudiziu à a stabilità coloidale di AgNPs terminati da citrate.Cunsiderendu a cuncentrazione di condensazione critica (CCC) di NaCl nantu à sistemi AgNP simili, questi risultati ponu esse disposti in modu intelligente in a literatura pertinente.Huynh et al.hà calculatu chì u CCC di NaCl per i nanoparticuli d'argentu terminati da citrate cù un diametru mediu di 71 nm era 47,6 mM, mentri El Badawy et al.hà osservatu chì u CCC di 10 nm AgNPs cù revestimentu di citrate era 70 mM.10,16 Inoltre, u CCC significativamente altu di circa 300 mM hè statu misuratu da He et al., chì hà causatu u so metudu di sintesi per esse sfarente da a publicazione citata prima.48 Ancu s'ellu a cuntribuzione attuale ùn hè micca diretta à un analisi cumpletu di sti valori, perchè e nostre cundizioni sperimentali sò in crescita in a cumplessità di u studiu tutale, a cuncentrazione di NaCl biologicamente pertinente di 50 mM, in particulare 150 mM NaCl, pare esse abbastanza alta.Coagulazione indotta, spieghendu i forti cambiamenti rilevati.
U prossimu passu in l'esperimentu di polimerizazione hè di utilizà molécule simplici ma biologicamente pertinenti per simulà l'interazzione nanoparticule-biomolecule.Basatu nantu à i risultati DLS (Figure 6 è 7) è UV-Vis (Figure Supplementari S3 è S4), alcune cunclusioni generale ponu esse affirmate.In e nostre cundizioni sperimentali, e molécule studiate glucose è glutamine ùn induceranu micca l'agregazione in alcun sistema AgNP, perchè a tendenza Z-mean hè strettamente ligata à u valore di misurazione di riferimentu currispundente.Ancu s'è a so prisenza ùn affetta micca l'aggregazione, i risultati spirimintali mostranu chì sti molécule sò adsorbiti parzialmente nantu à a superficia di AgNP.U risultatu più prominente chì sustene sta vista hè u cambiamentu osservatu in l'assorbimentu di luce.Ancu l'AgNP-I ùn mostra micca cambiamenti significativi di lunghezza d'onda o intensità, pò esse osservatu più chjaramente misurà particelle più grandi, chì hè più prubabile per a più grande sensibilità ottica citata prima.Indipendentemente da a cuncentrazione, u glucose pò causà un shift rossu più grande dopu à 1,5 ore cumparatu cù a misurazione di cuntrollu, chì hè di circa 40 nm in AgNP-II è di circa 10 nm in AgNP-III, chì prova l'occurrence di interazzione di superficia.Glutamine hà dimustratu una tendenza simili, ma u cambiamentu ùn era micca cusì evidenti.Inoltre, vale a pena nutà chì a glutamina pò riduce u potenziale zeta assolutu di particeddi mediu è grande.In ogni casu, postu chì questi cambiamenti zeta ùn parenu micca affettà u livellu di aggregazione, pò esse speculatu chì ancu i picculi biomoleculi cum'è glutamine ponu furnisce un certu gradu di repulsione spaziale trà e particelle.
Figura 6 I risultati di scattering di luce dinamica di campioni di nanoparticule d'argentu terminati da citrate cù una dimensione crescente (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II è 50 nm: AgNP-III) sò espressi cum'è u diametru idrodinamicu mediu (Z media) (diritta) In cundizioni esterni di cuncentrazione di glucose diffirenti, u potenziale zeta (a manca) cambia in 24 ore.
Figura 7 I risultati di scattering di luce dinamica di l'esemplari di nanoparticule d'argentu terminati in citrate cù una dimensione crescente (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II è 50 nm: AgNP-III) sò espressi cum'è u diametru idrodinamicu mediu (Z media). ) (diritta) In presenza di glutamine, u potenziale zeta (left) cambia in 24 ore.
In breve, i picculi biomoleculi cum'è glucose è glutamine ùn anu micca a stabilità coloidale à a cuncentrazione misurata: ancu s'ellu affettanu u potenziale zeta è i risultati UV-Vis à varii gradi, i risultati medii Z ùn sò micca cunsistenti.Questu indica chì l'adsorzione di a superficia di e molécule inibisce a repulsione elettrostatica, ma à u stessu tempu furnisce stabilità dimensionale.
Per ligà i risultati precedenti cù i risultati precedenti è simulà e cundizioni biologiche più abilmente, avemu sceltu alcuni di i cumpunenti di a cultura cellulare più cumuni è l'utilizamu cum'è cundizioni sperimentali per studià a stabilità di i colloidi AgNP.In tuttu l'esperimentu in vitro, una di e funzioni più impurtanti di DMEM cum'è un mediu hè di stabilisce e cundizioni osmotichi necessarii, ma da un puntu di vista chimicu, hè una solu suluzione cumplessa cù una forza ionica tutale simile à 150 mM NaCl. .40 In quantu à FBS, hè una mistura cumplessa di biomolecules-principalmente proteini-da u puntu di vista di l'adsorption di a superficia, hà qualchì similarità cù i risultati spirimintali di glucose è glutamine, malgradu a cumpusizioni chimica è a diversità Sessu hè assai più cumplicatu.19 DLS è UV-I risultati visibili mostrati in a Figura 8 è a Figura Supplementaria S5, rispettivamente, ponu esse spiegati esaminendu a cumpusizioni chimica di questi materiali è in correlazione cù e misurazioni in a sezione precedente.
Figura 8 I risultati di scattering di luce dinamica di l'esemplari di nanoparticule d'argentu terminati in citrate cù una dimensione crescente (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II è 50 nm: AgNP-III) sò espressi cum'è u diametru idrodinamicu mediu (Z media). ) (diritta) In presenza di cumpunenti di cultura cellulare DMEM è FBS, u potenziale zeta (left) cambia in 24 ore.
A diluzione di AgNPs di diverse dimensioni in DMEM hà un effettu simili nantu à a stabilità colloidale à quellu osservatu in a presenza di alta concentrazione di NaCl.A dispersione di AgNP in 50 v / v% DMEM hà dimustratu chì l'agregazione à grande scala hè stata rilevata cù l'aumentu di u potenziale zeta è u valore mediu Z è a forte diminuzione di l'intensità SPR.Hè da nutà chì a dimensione massima di l'agregatu indotta da DMEM dopu à 24 ore hè inversamente proporzionale à a dimensione di nanoparticule di prima.
L'interazzione trà FBS è AgNP hè simile à quella osservata in presenza di molécule più chjuche cum'è glucose è glutamine, ma l'effettu hè più forte.A media Z di e particelle ùn hè micca affettata, mentre chì un aumentu di u putenziale zeta hè rilevatu.U piccu SPR hà dimustratu un ligeru russu rossu, ma forsi più interessante, l'intensità SPR ùn hè micca diminuite significativamente cum'è in a misurazione di cuntrollu.Questi risultati ponu esse spiegati da l'adsorption innata di macromolecule nantu à a superficia di nanoparticulate (fila di fondu in Figura 4), chì hè avà capitu cum'è a furmazione di corona biomolecular in u corpu.49