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As nanopartículas menores são sempre melhores?Compreender os efeitos biológicos da agregação dependente do tamanho de nanopartículas de prata sob condições biologicamente relevantes
Autores: Bélteky P, Rónavari A, Zakupszky D, Boka E, Igaz N, Szerencsés B, Pfeiffer I, Vágvölgyi C, Kiricsi M, Kónya Z
Péter Bélteky,1,* Andrea Rónavari,1,* Dalma Zakupszky,1 Eszter Boka,1 Nóra Igaz,2 Bettina Szerencsés,3 Ilona Pfeiffer,3 Csaba Vágvölgyi,3 Mónika Kiricsi de Química Ambiental, Hungria, Hungria Faculdade de Ciências e Informática , Universidade de Szeged;2 Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Faculdade de Ciências e Informação, Universidade de Szeged, Hungria;3 Departamento de Microbiologia, Faculdade de Ciências e Informação, Universidade de Szeged, Hungria;4MTA-SZTE Reaction Kinetics and Surface Chemistry Research Group, Szeged, Hungria* Esses autores contribuíram igualmente para este trabalho.Comunicação: Zoltán Kónya Departamento de Química Aplicada e Ambiental, Faculdade de Ciências e Informática, Universidade de Szeged, Rerrich Square 1, Szeged, H-6720, Hungria Telefone +36 62 544620 Email [Proteção de email] Objetivo: Nanopartículas de prata (AgNPs) são um dos nanomateriais mais estudados, principalmente devido às suas aplicações biomédicas.No entanto, devido à agregação de nanopartículas, a sua excelente citotoxicidade e atividade antibacteriana são frequentemente comprometidas em meios biológicos.Neste trabalho, foram estudados o comportamento de agregação e as atividades biológicas relacionadas de três diferentes amostras de nanopartículas de prata terminadas em citrato com diâmetro médio de 10, 20 e 50 nm.Método: Utilizar microscópio eletrônico de transmissão para sintetizar e caracterizar nanopartículas, avaliar seu comportamento de agregação em diversos valores de pH, concentrações de NaCl, glicose e glutamina por espalhamento dinâmico de luz e espectroscopia ultravioleta-visível.Além disso, no meio de cultura celular, componentes como Dulbecco melhoram o comportamento de agregação em Eagle Medium e Fetal Calf Serum.Resultados: Os resultados mostram que o pH ácido e o conteúdo fisiológico de eletrólitos geralmente induzem agregação em escala micrométrica, que pode ser mediada pela formação de coroa biomolecular.É importante notar que partículas maiores apresentam maior resistência a influências externas do que suas contrapartes menores.Testes in vitro de citotoxicidade e antibacterianos foram realizados tratando células com agregados de nanopartículas em diferentes estágios de agregação.Conclusão: Nossos resultados revelam uma profunda correlação entre a estabilidade coloidal e a toxicidade das AgNPs, uma vez que a agregação extrema leva à perda completa da atividade biológica.O maior grau de antiagregação observado para partículas maiores tem um impacto significativo na toxicidade in vitro, porque tais amostras retêm mais atividade antimicrobiana e de células de mamíferos.Estas descobertas levam à conclusão de que, apesar da opinião geral na literatura relevante, visar as menores nanopartículas possíveis pode não ser o melhor curso de ação.Palavras-chave: crescimento mediado por sementes, estabilidade coloidal, comportamento de agregação dependente do tamanho, toxicidade por dano de agregação
À medida que a procura e a produção de nanomateriais continuam a aumentar, cada vez mais atenção é dada à sua biossegurança ou atividade biológica.As nanopartículas de prata (AgNPs) são um dos representantes desta classe de materiais mais comumente sintetizados, pesquisados ​​e utilizados devido às suas excelentes propriedades catalíticas, ópticas e biológicas.1 Acredita-se geralmente que as características únicas dos nanomateriais (incluindo AgNPs) são atribuídas principalmente à sua grande área superficial específica.Portanto, o problema inevitável é que qualquer processo que afete esta característica fundamental, como tamanho de partícula, revestimento superficial ou agregação, irá danificar gravemente as propriedades das nanopartículas que são críticas para aplicações específicas.
Os efeitos do tamanho das partículas e dos estabilizadores são assuntos relativamente bem documentados na literatura.Por exemplo, a visão geralmente aceita é que as nanopartículas menores são mais tóxicas que as nanopartículas maiores.2 Consistente com a literatura geral, nossos estudos anteriores demonstraram a atividade dependente do tamanho da nanoprata em células e microrganismos de mamíferos.3–5 O revestimento superficial é outro atributo que tem ampla influência nas propriedades dos nanomateriais.Apenas adicionando ou modificando estabilizadores em sua superfície, o mesmo nanomaterial pode ter propriedades físicas, químicas e biológicas completamente diferentes.A aplicação de agentes de proteção é mais frequentemente realizada como parte da síntese de nanopartículas.Por exemplo, nanopartículas de prata terminadas em citrato são um dos AgNPs mais relevantes na pesquisa, que são sintetizados pela redução de sais de prata em uma solução estabilizadora selecionada como meio de reação.6 O citrato pode facilmente tirar vantagem do seu baixo custo, disponibilidade, biocompatibilidade e forte afinidade pela prata, o que pode ser refletido em várias interações propostas, desde a adsorção superficial reversível até interações iônicas.Moléculas pequenas e íons poliatômicos próximos a 7,8, como citratos, polímeros, polieletrólitos e agentes biológicos também são comumente usados ​​para estabilizar a nanoprata e realizar funcionalizações únicas nela.9-12
Embora a possibilidade de alterar a atividade das nanopartículas por capeamento superficial intencional seja uma área muito interessante, o papel principal deste revestimento superficial é insignificante, proporcionando estabilidade coloidal ao sistema de nanopartículas.A grande área superficial específica dos nanomateriais produzirá grande energia superficial, o que dificulta a capacidade termodinâmica do sistema de atingir sua energia mínima.13 Sem a estabilização adequada, isto pode levar à aglomeração de nanomateriais.Agregação é a formação de agregados de partículas de vários formatos e tamanhos que ocorre quando partículas dispersas se encontram e as interações termodinâmicas atuais permitem que as partículas adiram umas às outras.Portanto, estabilizadores são usados ​​para evitar a agregação, introduzindo uma força repulsiva suficientemente grande entre as partículas para neutralizar a sua atração termodinâmica.14
Embora o tema do tamanho das partículas e da cobertura superficial tenha sido exaustivamente explorado no contexto da regulação das atividades biológicas desencadeadas pelas nanopartículas, a agregação de partículas é uma área amplamente negligenciada.Quase não há estudo completo para resolver a estabilidade coloidal de nanopartículas sob condições biologicamente relevantes.10,15-17 Além disso, esta contribuição é particularmente rara, onde também foi estudada a toxicidade associada à agregação, mesmo que possa causar reações adversas, como trombose vascular, ou perda de características desejadas, como sua toxicidade, como mostrado na Figura 1.18, 19 mostrado.Na verdade, um dos poucos mecanismos conhecidos de resistência às nanopartículas de prata está relacionado à agregação, porque certas cepas de E. coli e Pseudomonas aeruginosa reduzem sua sensibilidade à nanoprata ao expressar a proteína flagelina, flagelina.Possui alta afinidade pela prata, induzindo assim a agregação.20
Existem vários mecanismos diferentes relacionados à toxicidade das nanopartículas de prata, e a agregação afeta todos esses mecanismos.O método mais discutido de atividade biológica das AgNP, às vezes referido como mecanismo “Cavalo de Tróia”, considera as AgNPs como transportadores de Ag+.1,21 O mecanismo do cavalo de Tróia pode garantir um grande aumento na concentração local de Ag+, o que leva à geração de ERO e à despolarização da membrana.22-24 A agregação pode afetar a liberação de Ag+, afetando assim a toxicidade, porque reduz a superfície ativa efetiva onde os íons de prata podem ser oxidados e dissolvidos.No entanto, as AgNPs não exibirão toxicidade apenas através da liberação de íons.Muitas interações relacionadas ao tamanho e à morfologia devem ser consideradas.Entre elas, o tamanho e a forma da superfície das nanopartículas são as características definidoras.4,25 O conjunto desses mecanismos pode ser categorizado como “mecanismos de toxicidade induzida”.Existem potencialmente muitas reações mitocondriais e de membrana superficial que podem danificar organelas e causar a morte celular.25-27 Uma vez que a formação de agregados afecta naturalmente o tamanho e a forma dos objectos que contêm prata reconhecidos pelos sistemas vivos, estas interacções também podem ser afectadas.
Em nosso artigo anterior sobre a agregação de nanopartículas de prata, demonstramos um procedimento de triagem eficaz que consiste em experimentos químicos e biológicos in vitro para estudar este problema.19 O espalhamento dinâmico de luz (DLS) é a técnica preferida para esses tipos de inspeções porque o material pode espalhar fótons em um comprimento de onda comparável ao tamanho de suas partículas.Como a velocidade do movimento browniano das partículas no meio líquido está relacionada ao tamanho, a mudança na intensidade da luz espalhada pode ser usada para determinar o diâmetro hidrodinâmico médio (média Z) da amostra líquida.28 Além disso, ao aplicar uma voltagem à amostra, o potencial zeta (potencial ζ) da nanopartícula pode ser medido de forma semelhante ao valor médio Z.13,28 Se o valor absoluto do potencial zeta for alto o suficiente (de acordo com as diretrizes gerais> ±30 mV), gerará forte repulsão eletrostática entre as partículas para neutralizar a agregação.A ressonância plasmônica de superfície característica (SPR) é um fenômeno óptico único, atribuído principalmente a nanopartículas de metais preciosos (principalmente Au e Ag).29​​ Com base nas oscilações eletrônicas (plasmons de superfície) desses materiais em nanoescala, sabe-se que AgNPs esféricos possuem um pico característico de absorção de UV-Vis próximo a 400 nm.30 A intensidade e a mudança de comprimento de onda das partículas são usadas para complementar os resultados do DLS, pois este método pode ser usado para detectar agregação de nanopartículas e adsorção superficial de biomoléculas.
Com base nas informações obtidas, a viabilidade celular (MTT) e os ensaios antibacterianos são realizados de uma maneira em que a toxicidade da AgNP é descrita como uma função do nível de agregação, em vez da concentração de nanopartículas (o fator mais comumente usado).Este método único permite-nos demonstrar a profunda importância do nível de agregação na actividade biológica, porque, por exemplo, AgNPs terminados em citrato perdem completamente a sua actividade biológica dentro de poucas horas devido à agregação.19
No presente trabalho, pretendemos expandir enormemente nossas contribuições anteriores na estabilidade de colóides bio-relacionados e seu impacto na atividade biológica, estudando o efeito do tamanho das nanopartículas na agregação de nanopartículas.Este é sem dúvida um dos estudos de nanopartículas.Uma perspectiva de maior perfil e 31 Para investigar esta questão, um método de crescimento mediado por sementes foi usado para produzir AgNPs terminadas em citrato em três faixas de tamanho diferentes (10, 20 e 50 nm).6,32 como um dos métodos mais comuns.Para nanomateriais que são amplamente e rotineiramente utilizados em aplicações médicas, AgNPs de diferentes tamanhos terminados em citrato são selecionados para estudar a possível dependência do tamanho das propriedades biológicas relacionadas à agregação da nanoprata.Após sintetizar AgNPs de diferentes tamanhos, caracterizamos as amostras produzidas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e, em seguida, examinamos as partículas utilizando o procedimento de triagem mencionado anteriormente.Além disso, na presença de culturas celulares in vitro, Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) e Soro Fetal Bovino (FBS), o comportamento de agregação dependente do tamanho e seu comportamento foram avaliados em vários valores de pH, concentrações de NaCl, glicose e glutamina.As características da citotoxicidade são determinadas em condições abrangentes.O consenso científico indica que, em geral, são preferíveis partículas mais pequenas;nossa investigação fornece uma plataforma química e biológica para determinar se este é o caso.
Três nanopartículas de prata com diferentes faixas de tamanho foram preparadas pelo método de crescimento mediado por sementes proposto por Wan et al., com pequenos ajustes.6 Este método é baseado na redução química, utilizando nitrato de prata (AgNO3) como fonte de prata, borohidreto de sódio (NaBH4) como agente redutor e citrato de sódio como estabilizante.Primeiro, prepare 75 mL de solução aquosa de citrato 9 mM a partir de citrato de sódio di-hidratado (Na3C6H5O7 x 2H2O) e aqueça a 70°C.Em seguida, 2 mL de solução de AgNO3 a 1% p/v foram adicionados ao meio de reação e, em seguida, a solução de borohidreto de sódio recém-preparada (2 mL a 0,1% p/v) foi vertida na mistura gota a gota.A suspensão amarelo-castanha resultante foi mantida a 70°C com agitação vigorosa durante 1 hora e depois arrefecida até à temperatura ambiente.A amostra resultante (referida como AgNP-I de agora em diante) é usada como base para o crescimento mediado por sementes na próxima etapa de síntese.
Para sintetizar uma suspensão de partículas de tamanho médio (denotada como AgNP-II), aqueça 90 mL de solução de citrato 7,6 mM a 80°C, misture com 10 mL de AgNP-I e, em seguida, misture 2 mL de solução de AgNO3 a 1% p/v. foi mantida sob agitação mecânica vigorosa por 1 hora e então a amostra foi resfriada até a temperatura ambiente.
Para a partícula maior (AgNP-III), repita o mesmo processo de crescimento, mas neste caso, use 10 mL de AgNP-II como suspensão de sementes.Após as amostras atingirem a temperatura ambiente, elas ajustam sua concentração nominal de Ag com base no conteúdo total de AgNO3 para 150 ppm adicionando ou evaporando solvente adicional a 40°C e, finalmente, armazenam-nas a 4°C até uso posterior.
Use o microscópio eletrônico de transmissão FEI Tecnai G2 20 X-Twin (TEM) (sede corporativa da FEI, Hillsboro, Oregon, EUA) com tensão de aceleração de 200 kV para examinar as características morfológicas das nanopartículas e capturar seu padrão de difração de elétrons (ED).Pelo menos 15 imagens representativas (~750 partículas) foram avaliadas usando o pacote de software ImageJ, e os histogramas resultantes (e todos os gráficos de todo o estudo) foram criados no OriginPro 2018 (OriginLab, Northampton, MA, EUA) 33, 34.
O diâmetro hidrodinâmico médio (média Z), potencial zeta (potencial ζ) e ressonância plasmônica de superfície característica (SPR) das amostras foram medidos para ilustrar suas propriedades coloidais iniciais.O diâmetro hidrodinâmico médio e o potencial zeta da amostra foram medidos pelo instrumento Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK) utilizando células capilares dobradas descartáveis ​​a 37±0,1°C.O espectrofotômetro UV-Vis Ocean Optics 355 DH-2000-BAL (Halma PLC, Largo, FL, EUA) foi utilizado para obter características SPR características dos espectros de absorção UV-Vis de amostras na faixa de 250-800 nm.
Durante todo o experimento, três tipos diferentes de medições relacionadas à estabilidade coloidal foram realizados ao mesmo tempo.Use DLS para medir o diâmetro hidrodinâmico médio (média Z) e o potencial zeta (potencial ζ) das partículas, porque a média Z está relacionada ao tamanho médio dos agregados de nanopartículas, e o potencial zeta indica se a repulsão eletrostática no sistema é forte o suficiente para compensar a atração de Van der Waals entre nanopartículas.As medições são feitas em triplicado e o desvio padrão da média Z e do potencial zeta é calculado pelo software Zetasizer.Os espectros SPR característicos das partículas são avaliados por espectroscopia UV-Vis, porque mudanças na intensidade do pico e no comprimento de onda podem indicar agregação e interações superficiais.29,35 Na verdade, a ressonância plasmônica de superfície em metais preciosos é tão influente que levou a novos métodos de análise de biomoléculas.29,36,37 A concentração de AgNPs na mistura experimental é de cerca de 10 ppm, e o objetivo é definir a intensidade da absorção inicial máxima do SPR para 1. O experimento foi realizado de maneira dependente do tempo em 0;1,5;3;6;12 e 24 horas sob diversas condições biologicamente relevantes.Mais detalhes descrevendo o experimento podem ser vistos em nosso trabalho anterior.19 Em suma, vários valores de pH (3; 5; 7,2 e 9), diferentes concentrações de cloreto de sódio (10 mM; 50 mM; 150 mM), glicose (3,9 mM; 6,7 mM) e glutamina (4 mM), e também preparou Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) e Soro Fetal Bovino (FBS) (em água e DMEM) como sistemas modelo, e estudou seus efeitos no comportamento de agregação das nanopartículas de prata sintetizadas.pH Os valores de NaCl, glicose e glutamina são avaliados com base nas concentrações fisiológicas, enquanto as quantidades de DMEM e FBS são iguais aos níveis utilizados em todo o experimento in vitro.38-42 Todas as medições foram realizadas em pH 7,2 e 37°C com uma concentração constante de sal de fundo de 10 mM de NaCl para eliminar quaisquer interações de partículas de longa distância (exceto para certos experimentos relacionados a pH e NaCl, onde esses atributos são as variáveis ​​sob estudar).28 A lista de diversas condições está resumida na Tabela 1. O experimento marcado com † é usado como referência e corresponde a uma amostra contendo NaCl 10 mM e pH 7,2.
A linhagem celular de câncer de próstata humano (DU145) e queratinócitos humanos imortalizados (HaCaT) foram obtidos da ATCC (Manassas, VA, EUA).As células são rotineiramente cultivadas em meio essencial mínimo Eagle de Dulbecco (DMEM) contendo 4,5 g/L de glicose (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EUA), suplementado com 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 0,01% de estreptomicina e 0,005% Penicilina (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA).As células são cultivadas numa incubadora a 37°C sob 5% de CO2 e 95% de humidade.
A fim de explorar as alterações na citotoxicidade do AgNP causadas pela agregação de partículas de uma maneira dependente do tempo, foi realizado um ensaio MTT em duas etapas.Primeiro, a viabilidade dos dois tipos de células foi medida após tratamento com AgNP-I, AgNP-II e AgNP-III.Para tanto, os dois tipos de células foram semeados em placas de 96 poços a uma densidade de 10.000 células/poço e tratados com três tamanhos diferentes de nanopartículas de prata em concentrações crescentes no segundo dia.Após 24 horas de tratamento, as células foram lavadas com PBS e incubadas com 0,5 mg/mL de reagente MTT (SERVA, Heidelberg, Alemanha) diluído em meio de cultura por 1 hora a 37°C.Os cristais de Formazan foram dissolvidos em DMSO (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EUA) e a absorção foi medida a 570 nm utilizando um leitor de placas Synergy HTX (BioTek-Hungary, Budapeste, Hungria).O valor de absorção da amostra de controle não tratada é considerado como sendo uma taxa de sobrevivência de 100%.Realize pelo menos 3 experimentos usando quatro réplicas biológicas independentes.A IC50 é calculada a partir de uma curva de resposta à dose baseada nos resultados de vitalidade.
Posteriormente, na segunda etapa, incubando as partículas com NaCl 150 mM por diferentes períodos de tempo (0, 1,5, 3, 6, 12 e 24 horas) antes do tratamento celular, foram produzidos diferentes estados de agregação de nanopartículas de prata.Posteriormente, o mesmo ensaio MTT foi realizado conforme descrito anteriormente para avaliar alterações na viabilidade celular afetadas pela agregação de partículas.Use o GraphPad Prism 7 para avaliar o resultado final, calcule a significância estatística do experimento pelo teste t não pareado e marque seu nível como * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01), *** (p ≤ 0,001). ) E **** (p ≤ 0,0001).
Três tamanhos diferentes de nanopartículas de prata (AgNP-I, AgNP-II e AgNP-III) foram utilizados para suscetibilidade antibacteriana a Cryptococcus neoformans IFM 5844 (IFM; Centro de Pesquisa para Fungos Patogênicos e Toxicologia Microbiana, Universidade de Chiba) e Bacillus Test megaterium SZMC 6031 (SZMC: Szeged Microbiology Collection) e E. coli SZMC 0582 em meio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Co.).Para avaliar as alterações na atividade antibacteriana causadas pela agregação de partículas, primeiro, determinou-se a sua concentração inibitória mínima (CIM) por microdiluição em placa de microtitulação de 96 poços.A 50 μL de suspensão celular padronizada (5 × 104 células/mL em meio RPMI 1640), adicione 50 μL de suspensão de nanopartículas de prata e dilua em série duas vezes a concentração (no meio mencionado, a faixa é de 0 e 75 ppm, ou seja, a amostra controle contém 50 μL de suspensão celular e 50 μL de meio sem nanopartículas).Posteriormente, a placa foi incubada a 30°C durante 48 horas e a densidade óptica da cultura foi medida a 620 nm utilizando um leitor de placas SPECTROstar Nano (BMG LabTech, Offenburg, Alemanha).O experimento foi realizado três vezes em triplicata.
Exceto que 50 μL de amostras únicas de nanopartículas agregadas foram utilizadas neste momento, o mesmo procedimento descrito anteriormente foi usado para examinar o efeito da agregação na atividade antibacteriana nas cepas acima mencionadas.Diferentes estados de agregação de nanopartículas de prata são produzidos incubando as partículas com NaCl 150 mM por diferentes períodos de tempo (0, 1,5, 3, 6, 12 e 24 horas) antes do processamento celular.Uma suspensão suplementada com 50 μL de meio RPMI 1640 foi utilizada como controle de crescimento, enquanto para controle de toxicidade foi utilizada uma suspensão com nanopartículas não agregadas.O experimento foi realizado três vezes em triplicata.Use o GraphPad Prism 7 para avaliar o resultado final novamente, usando a mesma análise estatística da análise MTT.
O nível de agregação das menores partículas (AgNP-I) foi caracterizado, e os resultados foram parcialmente publicados em nosso trabalho anterior, mas para uma melhor comparação, todas as partículas foram minuciosamente peneiradas.Os dados experimentais são coletados e discutidos nas seções seguintes.Três tamanhos de AgNP.19
Medições realizadas por TEM, UV-Vis e DLS verificaram o sucesso da síntese de todas as amostras AgNP (Figura 2A-D).De acordo com a primeira linha da Figura 2, a menor partícula (AgNP-I) apresenta uma morfologia esférica uniforme com diâmetro médio de cerca de 10 nm.O método de crescimento mediado por sementes também fornece AgNP-II e AgNP-III com diferentes faixas de tamanho, com diâmetros médios de partículas de aproximadamente 20 nm e 50 nm, respectivamente.De acordo com o desvio padrão da distribuição das partículas, os tamanhos das três amostras não se sobrepõem, o que é importante para a sua análise comparativa.Ao comparar a proporção média de aspecto e a proporção de espessura das projeções 2D de partículas baseadas em TEM, assume-se que a esfericidade das partículas é avaliada pelo plug-in de filtro de forma do ImageJ (Figura 2E).43 De acordo com a análise da forma das partículas, sua proporção de aspecto (lado grande/lado curto do menor retângulo delimitador) não é afetada pelo crescimento das partículas, e sua proporção de espessura (área medida do círculo perfeito correspondente/área teórica ) diminui gradualmente.Isto resulta em cada vez mais partículas poliédricas, que são perfeitamente redondas em teoria, correspondendo a uma proporção de espessura de 1.
Figura 2 Imagem de microscópio eletrônico de transmissão (TEM) (A), padrão de difração de elétrons (ED) (B), histograma de distribuição de tamanho (C), espectro característico de absorção de luz ultravioleta-visível (UV-Vis) (D) e citrato fluido médio nanopartículas de prata terminadas com diâmetro mecânico (média Z), potencial zeta, proporção de aspecto e proporção de espessura (E) têm três faixas de tamanho diferentes: AgNP-I é 10 nm (linha superior), AgNP -II é 20 nm (linha do meio ), AgNP-III (linha inferior) é 50 nm.
Embora a natureza cíclica do método de crescimento tenha afetado até certo ponto o formato das partículas, resultando na menor esfericidade de AgNPs maiores, todas as três amostras permaneceram quase esféricas.Além disso, conforme mostrado no padrão de difração de elétrons na Figura 2B, nano A cristalinidade das partículas não é afetada.O proeminente anel de difração - que pode ser correlacionado com os índices de prata (111), (220), (200) e (311) Miller - é muito consistente com a literatura científica e nossas contribuições anteriores.9, 19,44 A fragmentação do anel Debye-Scherrer de AgNP-II e AgNP-III se deve ao fato da imagem ED ser capturada na mesma ampliação, de modo que à medida que o tamanho da partícula aumenta, o número de partículas difratadas por a área da unidade aumenta e diminui.
Sabe-se que o tamanho e a forma das nanopartículas afetam a atividade biológica.3,45 A atividade catalítica e biológica dependente da forma pode ser explicada pelo fato de que diferentes formas tendem a proliferar certas faces do cristal (tendo diferentes índices de Miller), e essas faces do cristal têm atividades diferentes.45,46 Uma vez que as partículas preparadas fornecem resultados de ED semelhantes correspondendo a características cristalinas muito semelhantes, pode-se presumir que em nossos experimentos subsequentes de estabilidade coloidal e atividade biológica, quaisquer diferenças observadas devem ser atribuídas ao tamanho das nanopartículas, e não às propriedades relacionadas à forma.
Os resultados de UV-Vis resumidos na Figura 2D enfatizam ainda mais a esmagadora natureza esférica do AgNP sintetizado, porque os picos de SPR de todas as três amostras estão em torno de 400 nm, que é um valor característico das nanopartículas esféricas de prata.29,30 Os espectros capturados também confirmaram o crescimento bem-sucedido da nanoprata mediado por sementes.À medida que o tamanho da partícula aumenta, o comprimento de onda correspondente à absorção máxima de luz do AgNP-II - com mais destaque - de acordo com a literatura, o AgNP-III experimentou um desvio para o vermelho.6,29
Em relação à estabilidade coloidal inicial do sistema AgNP, o DLS foi utilizado para medir o diâmetro hidrodinâmico médio e o potencial zeta das partículas em pH 7,2.Os resultados representados na Figura 2E mostram que o AgNP-III tem maior estabilidade coloidal do que o AgNP-I ou AgNP-II, porque as diretrizes comuns indicam que um potencial zeta de 30 mV absoluto é necessário para a estabilidade coloidal a longo prazo. o valor médio de Z (obtido como o diâmetro hidrodinâmico médio das partículas livres e agregadas) é comparado com o tamanho de partícula primária obtido por TEM, pois quanto mais próximos os dois valores estiverem, mais suave será o grau de Gather na amostra.Na verdade, a média Z de AgNP-I e AgNP-II é razoavelmente maior do que o tamanho de partícula principal avaliado por TEM, portanto, em comparação com AgNP-III, prevê-se que essas amostras tenham maior probabilidade de agregar, onde o potencial zeta altamente negativo é acompanhado por um tamanho próximo do valor médio Z.
A explicação para este fenômeno pode ser dupla.Por um lado, a concentração de citrato é mantida em um nível semelhante em todas as etapas de síntese, fornecendo uma quantidade relativamente alta de grupos de superfície carregados para evitar que a área superficial específica das partículas em crescimento diminua.Porém, segundo Levak et al., moléculas pequenas como o citrato podem ser facilmente trocadas por biomoléculas na superfície das nanopartículas.Neste caso, a estabilidade coloidal será determinada pela coroa das biomoléculas produzidas.31 Como esse comportamento também foi observado em nossas medições de agregação (discutidas com mais detalhes posteriormente), o capeamento de citrato por si só não pode explicar esse fenômeno.
Por outro lado, o tamanho da partícula é inversamente proporcional à tendência de agregação em nível nanométrico.Isto é apoiado principalmente pelo método tradicional Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO), onde a atração de partículas é descrita como a soma das forças atrativas e repulsivas entre as partículas.Segundo He et al., o valor máximo da curva de energia DLVO diminui com o tamanho das nanopartículas nas nanopartículas de hematita, facilitando o alcance da energia primária mínima, promovendo assim agregação irreversível (condensação).47 Contudo, especula-se que existam outros aspectos além das limitações da teoria DLVO.Embora a gravidade de van der Waals e a repulsão eletrostática de camada dupla sejam semelhantes com o aumento do tamanho das partículas, uma revisão de Hotze et al.propõe que tenha um efeito mais forte na agregação do que o permitido pela DLVO.14 Eles acreditam que a curvatura da superfície das nanopartículas não pode mais ser estimada como uma superfície plana, tornando a estimativa matemática inaplicável.Além disso, à medida que o tamanho da partícula diminui, a porcentagem de átomos presentes na superfície aumenta, levando à estrutura eletrônica e ao comportamento da carga superficial.E alterações na reatividade superficial, que podem levar à diminuição da carga na dupla camada elétrica e promover agregação.
Ao comparar os resultados de DLS de AgNP-I, AgNP-II e AgNP-III na Figura 3, observamos que todas as três amostras apresentaram agregação de estímulo de pH semelhante.Um ambiente fortemente ácido (pH 3) muda o potencial zeta da amostra para 0 mV, fazendo com que as partículas formem agregados de tamanho micrométrico, enquanto o pH alcalino muda seu potencial zeta para um valor negativo maior, onde as partículas formam agregados menores (pH 5 ).E 7,2) ), ou permanecem completamente desagregados (pH 9).Algumas diferenças importantes entre as diferentes amostras também foram observadas.Ao longo do experimento, AgNP-I provou ser o mais sensível às alterações do potencial zeta induzidas pelo pH, pois o potencial zeta dessas partículas foi reduzido em pH 7,2 em comparação com pH 9, enquanto AgNP-II e AgNP-III apenas apresentaram A mudança considerável em ζ está em torno de pH 3. Além disso, AgNP-II apresentou alterações mais lentas e potencial zeta moderado, enquanto AgNP-III apresentou o comportamento mais suave dos três, porque o sistema apresentou o maior valor zeta absoluto e movimento de tendência lento, indicando AgNP-III Mais resistente à agregação induzida por pH.Estes resultados são consistentes com os resultados médios da medição do diâmetro hidrodinâmico.Considerando o tamanho de partícula de seus primers, AgNP-I apresentou agregação gradual constante em todos os valores de pH, provavelmente devido ao fundo de NaCl 10 mM, enquanto AgNP-II e AgNP-III só mostraram agregação significativa em pH 3 de agrupamento.A diferença mais interessante é que apesar do grande tamanho das nanopartículas, o AgNP-III forma os menores agregados em pH 3 em 24 horas, destacando suas propriedades antiagregantes.Ao dividir o Z médio de AgNPs em pH 3 após 24 horas pelo valor da amostra preparada, pode-se observar que os tamanhos agregados relativos de AgNP-I e AgNP-II aumentaram 50 vezes, 42 vezes e 22 vezes. , respectivamente.III.
Figura 3 Os resultados dinâmicos de dispersão de luz da amostra de nanopartículas de prata terminadas em citrato com tamanho crescente (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II e 50 nm: AgNP-III) são expressos como o diâmetro hidrodinâmico médio (Z média ) (direita) Sob diferentes condições de pH, o potencial zeta (esquerda) muda em 24 horas.
A agregação dependente do pH observada também afetou a característica ressonância plasmônica de superfície (SPR) das amostras AgNP, como evidenciado pelos seus espectros UV-Vis.De acordo com a Figura Suplementar S1, a agregação de todas as três suspensões de nanopartículas de prata é seguida por uma redução na intensidade dos seus picos de SPR e um desvio moderado para o vermelho.A extensão destas alterações em função do pH é consistente com o grau de agregação previsto pelos resultados do DLS, no entanto, foram observadas algumas tendências interessantes.Contrariamente à intuição, verifica-se que o AgNP-II de tamanho médio é o mais sensível às alterações de SPR, enquanto as outras duas amostras são menos sensíveis.Na pesquisa SPR, 50 nm é o limite teórico de tamanho de partícula, que é usado para distinguir partículas com base em suas propriedades dielétricas.Partículas menores que 50 nm (AgNP-I e AgNP-II) podem ser descritas como dipolos dielétricos simples, enquanto partículas que atingem ou excedem esse limite (AgNP-III) possuem propriedades dielétricas mais complexas, e sua ressonância A banda se divide em mudanças multimodais .No caso de duas amostras de partículas menores, os AgNPs podem ser considerados dipolos simples e o plasma pode facilmente se sobrepor.À medida que o tamanho das partículas aumenta, este acoplamento produz essencialmente um plasma maior, o que pode explicar a maior sensibilidade observada.29 No entanto, para as partículas maiores, a estimativa dipolo simples não é válida quando outros estados de acoplamento também podem ocorrer, o que pode explicar a tendência diminuída do AgNP-III de indicar alterações espectrais.29
Nas nossas condições experimentais, está provado que o valor do pH tem um efeito profundo na estabilidade coloidal de nanopartículas de prata revestidas com citrato de vários tamanhos.Nestes sistemas, a estabilidade é fornecida pelos grupos -COO- carregados negativamente na superfície dos AgNPs.O grupo funcional carboxilato do íon citrato é protonado em um grande número de íons H+, de modo que o grupo carboxila gerado não pode mais fornecer repulsão eletrostática entre as partículas, conforme mostrado na linha superior da Figura 4. De acordo com o princípio de Le Chatelier, AgNP as amostras agregam-se rapidamente em pH 3, mas gradualmente tornam-se cada vez mais estáveis ​​​​à medida que o pH aumenta.
Figura 4 Mecanismo esquemático de interação de superfície definido por agregação sob diferentes pH (linha superior), concentração de NaCl (linha do meio) e biomoléculas (linha inferior).
De acordo com a Figura 5, a estabilidade coloidal em suspensões de AgNP de diferentes tamanhos também foi examinada sob concentrações crescentes de sal.Com base no potencial zeta, o aumento do tamanho das nanopartículas nestes sistemas AgNP terminados em citrato proporciona novamente maior resistência a influências externas do NaCl.No AgNP-I, NaCl 10 mM é suficiente para induzir agregação moderada, e uma concentração de sal de 50 mM fornece resultados muito semelhantes.Em AgNP-II e AgNP-III, NaCl 10 mM não afeta significativamente o potencial zeta porque seus valores permanecem em (AgNP-II) ou abaixo (AgNP-III) -30 mV.Aumentar a concentração de NaCl para 50 mM e finalmente para 150 mM de NaCl é suficiente para reduzir significativamente o valor absoluto do potencial zeta em todas as amostras, embora partículas maiores retenham mais carga negativa.Estes resultados são consistentes com o diâmetro hidrodinâmico médio esperado das AgNPs;as linhas de tendência média Z medidas em NaCl 10, 50 e 150 mM mostram valores diferentes, aumentando gradualmente.Finalmente, agregados de tamanho micrométrico foram detectados em todos os três experimentos de 150 mM.
Figura 5 Os resultados dinâmicos de dispersão de luz da amostra de nanopartículas de prata terminadas em citrato com tamanho crescente (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II e 50 nm: AgNP-III) são expressos como o diâmetro hidrodinâmico médio (média Z ) (direita) e potencial zeta (esquerda) mudam dentro de 24 horas sob diferentes concentrações de NaCl.
Os resultados de UV-Vis na Figura Suplementar S2 mostram que o SPR de NaCl 50 e 150 mM em todas as três amostras tem uma diminuição instantânea e significativa.Isto pode ser explicado pelo DLS, porque a agregação baseada em NaCl ocorre mais rapidamente do que os experimentos dependentes de pH, o que é explicado pela grande diferença entre as medições iniciais (0, 1,5 e 3 horas).Além disso, aumentar a concentração de sal também aumentará a permissividade relativa do meio experimental, o que terá um efeito profundo na ressonância plasmônica de superfície.29
O efeito do NaCl está resumido na linha central da Figura 4. Em geral, pode-se concluir que o aumento da concentração de cloreto de sódio tem um efeito semelhante ao aumento da acidez, porque os íons Na+ têm tendência a se coordenar em torno dos grupos carboxilato, suprimindo AgNPs com potencial zeta negativo.Além disso, NaCl 150 mM produziu agregados de tamanho micrométrico em todas as três amostras, indicando que a concentração fisiológica de eletrólitos é prejudicial à estabilidade coloidal de AgNPs terminados em citrato.Ao considerar a concentração crítica de condensação (CCC) de NaCl em sistemas AgNP semelhantes, estes resultados podem ser habilmente colocados na literatura relevante.Huynh et al.calcularam que o CCC de NaCl para nanopartículas de prata terminadas em citrato com diâmetro médio de 71 nm foi de 47,6 mM, enquanto El Badawy et al.observaram que o CCC de AgNPs de 10 nm com revestimento de citrato era de 70 mM.10,16 Além disso, a CCC significativamente elevada de cerca de 300 mM foi medida por He et al., o que fez com que seu método de síntese fosse diferente da publicação mencionada anteriormente.48 Embora a contribuição atual não vise uma análise abrangente desses valores, porque nossas condições experimentais estão aumentando a complexidade de todo o estudo, a concentração biologicamente relevante de NaCl de 50 mM, especialmente NaCl 150 mM, parece ser bastante alta.Coagulação induzida, explicando as fortes alterações detectadas.
O próximo passo no experimento de polimerização é usar moléculas simples, mas biologicamente relevantes, para simular interações nanopartículas-biomoléculas.Com base nos resultados de DLS (Figuras 6 e 7) e UV-Vis (Figuras Suplementares S3 e S4), algumas conclusões gerais podem ser afirmadas.Sob nossas condições experimentais, as moléculas estudadas de glicose e glutamina não induzirão agregação em nenhum sistema AgNP, porque a tendência da média Z está intimamente relacionada ao valor de medição de referência correspondente.Embora sua presença não afete a agregação, resultados experimentais mostram que essas moléculas são parcialmente adsorvidas na superfície das AgNPs.O resultado mais proeminente que apoia esta visão é a mudança observada na absorção de luz.Embora o AgNP-I não exiba alterações significativas no comprimento de onda ou na intensidade, ele pode ser observado mais claramente medindo partículas maiores, o que provavelmente se deve à maior sensibilidade óptica mencionada anteriormente.Independentemente da concentração, a glicose pode causar um maior desvio para o vermelho após 1,5 horas em comparação com a medição de controle, que é de cerca de 40 nm no AgNP-II e cerca de 10 nm no AgNP-III, o que comprova a ocorrência de interações superficiais.A glutamina mostrou uma tendência semelhante, mas a mudança não foi tão óbvia.Além disso, vale ressaltar também que a glutamina pode reduzir o potencial zeta absoluto de partículas médias e grandes.No entanto, uma vez que estas alterações zeta não parecem afectar o nível de agregação, pode-se especular que mesmo pequenas biomoléculas como a glutamina podem proporcionar um certo grau de repulsão espacial entre as partículas.
Figura 6 Os resultados dinâmicos de dispersão de luz de amostras de nanopartículas de prata terminadas em citrato com tamanho crescente (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II e 50 nm: AgNP-III) são expressos como o diâmetro hidrodinâmico médio (Z média) (direita) Sob condições externas de diferentes concentrações de glicose, o potencial zeta (esquerda) muda dentro de 24 horas.
Figura 7 Os resultados dinâmicos de dispersão de luz da amostra de nanopartículas de prata terminadas em citrato com tamanho crescente (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II e 50 nm: AgNP-III) são expressos como o diâmetro hidrodinâmico médio (Z média ) (direita) Na presença de glutamina, o potencial zeta (esquerda) muda em 24 horas.
Em suma, pequenas biomoléculas como glicose e glutamina não afetam a estabilidade coloidal na concentração medida: embora afetem o potencial zeta e os resultados de UV-Vis em graus variados, os resultados médios Z não são consistentes.Isso indica que a adsorção superficial de moléculas inibe a repulsão eletrostática, mas ao mesmo tempo proporciona estabilidade dimensional.
A fim de vincular os resultados anteriores com os resultados anteriores e simular as condições biológicas com mais habilidade, selecionamos alguns dos componentes de cultura celular mais comumente utilizados e os utilizamos como condições experimentais para estudar a estabilidade de colóides AgNP.Em todo o experimento in vitro, uma das funções mais importantes do DMEM como meio é estabelecer as condições osmóticas necessárias, mas do ponto de vista químico, é uma solução salina complexa com força iônica total semelhante a 150 mM NaCl .40 Quanto ao FBS, é uma mistura complexa de biomoléculas - principalmente proteínas - do ponto de vista da adsorção superficial, apresenta algumas semelhanças com os resultados experimentais de glicose e glutamina, apesar da composição química e diversidade O sexo é muito mais complicado.19 DLS e UV - Os resultados visíveis mostrados na Figura 8 e na Figura Suplementar S5, respectivamente, podem ser explicados examinando a composição química desses materiais e correlacionando-os com as medidas da seção anterior.
Figura 8 Os resultados de dispersão dinâmica de luz da amostra de nanopartículas de prata terminadas em citrato com tamanho crescente (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II e 50 nm: AgNP-III) são expressos como o diâmetro hidrodinâmico médio (Z média ) (direita) Na presença de componentes de cultura celular DMEM e FBS, o potencial zeta (esquerda) muda dentro de 24 horas.
A diluição de AgNPs de diferentes tamanhos em DMEM tem efeito na estabilidade coloidal semelhante ao observado na presença de altas concentrações de NaCl.A dispersão do AgNP em 50 v / v% de DMEM mostrou que a agregação em larga escala foi detectada com o aumento do potencial zeta e do valor médio Z e a diminuição acentuada da intensidade do SPR.Vale ressaltar que o tamanho máximo do agregado induzido pelo DMEM após 24 horas é inversamente proporcional ao tamanho das nanopartículas do primer.
A interação entre FBS e AgNP é semelhante àquela observada na presença de moléculas menores como glicose e glutamina, mas o efeito é mais forte.A média Z das partículas permanece inalterada, enquanto é detectado um aumento no potencial zeta.O pico do SPR mostrou um ligeiro desvio para o vermelho, mas talvez o mais interessante é que a intensidade do SPR não diminuiu tão significativamente como na medição de controle.Esses resultados podem ser explicados pela adsorção inata de macromoléculas na superfície das nanopartículas (linha inferior da Figura 4), que hoje é entendida como a formação de uma coroa biomolecular no corpo.49