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더 작은 나노입자가 항상 더 나은가요?생물학적으로 관련된 조건에서 크기에 따른 은 나노입자 응집의 생물학적 효과 이해
저자: Bélteky P, Rónavári A, Zakupszky D, Boka E, Igaz N, Szerencsés B, Pfeiffer I, Vágvölgyi C, Kiricsi M, Kónya Z
Péter Bélteky,1,* Andrea Rónavári,1,* Dalma Zakupszky,1 Eszter Boka,1 Nóra Igaz,2 Bettina Szerencsés,3 Ilona Pfeiffer,3 Csaba Vágvölgyi,3 Mónika Kiricsi 환경 화학, 헝가리, 헝가리 과학 및 정보학 학부 , 세게드 대학교;2 헝가리 세게드대학교 과학정보학부 생화학 및 분자생물학과;3 헝가리 세게드대학교 과학정보학부 미생물학과;4MTA-SZTE 반응 역학 및 표면 화학 연구 그룹, 세게드, 헝가리* 이 저자들은 이 작업에 동일하게 기여했습니다.커뮤니케이션: Zoltán Kónya 응용 환경 화학과, 과학 및 정보학 학부, University of Szeged, Rerrich Square 1, Szeged, H-6720, 헝가리 전화 +36 62 544620 이메일 [이메일 보호] 목적: 은 나노입자(AgNP)는 특히 생의학적 응용으로 인해 가장 일반적으로 연구되는 나노물질 중 하나입니다.그러나 나노입자의 응집으로 인해 나노입자의 탁월한 세포독성 및 항균 활성이 생물학적 매체에서 손상되는 경우가 많습니다.이 연구에서는 평균 직경이 10, 20 및 50nm인 세 가지 다른 구연산염으로 종결된 은 나노입자 샘플의 응집 거동 및 관련 생물학적 활성을 연구했습니다.방법: 투과전자현미경을 사용하여 나노입자를 합성 및 특성화하고 동적 광산란 및 자외선-가시광선 분광학을 통해 다양한 pH 값, NaCl, 포도당 및 글루타민 농도에서 나노입자의 응집 거동을 평가합니다.또한 Dulbecco와 같은 세포 배양 배지 성분은 Eagle Medium 및 Fetal Calf Serum의 응집 거동을 향상시킵니다.결과: 결과는 산성 pH와 생리학적 전해질 함량이 일반적으로 생체분자 코로나의 형성에 의해 매개될 수 있는 마이크론 규모의 응집을 유도한다는 것을 보여줍니다.큰 입자는 작은 입자보다 외부 영향에 대한 저항력이 더 높다는 점은 주목할 가치가 있습니다.다양한 응집 단계에서 나노입자 응집체로 세포를 처리하여 시험관 내 세포 독성 및 항균 테스트를 수행했습니다.결론: 극단적인 응집은 생물학적 활성의 완전한 손실로 이어지기 때문에 우리의 결과는 콜로이드 안정성과 AgNP의 독성 사이의 심오한 상관관계를 보여줍니다.더 큰 입자에서 관찰된 더 높은 수준의 항응집은 시험관 내 독성에 상당한 영향을 미칩니다. 왜냐하면 이러한 샘플은 더 많은 항균 및 포유류 세포 활성을 유지하기 때문입니다.이러한 발견은 관련 문헌의 일반적인 의견에도 불구하고 가능한 가장 작은 나노입자를 표적으로 삼는 것이 최선의 조치가 아닐 수 있다는 결론으로 ​​이어집니다.키워드: 종자 매개 성장, 콜로이드 안정성, 크기 의존적 응집 거동, 응집 손상 독성
나노물질의 수요와 생산량이 지속적으로 증가함에 따라 나노물질의 생물학적 안전성이나 생물학적 활성에 대한 관심이 점점 더 높아지고 있습니다.은 나노입자(AgNP)는 탁월한 촉매, 광학 및 생물학적 특성으로 인해 가장 일반적으로 합성, 연구 및 활용되는 이러한 종류의 재료 중 하나입니다.1 일반적으로 나노물질(AgNP 포함)의 독특한 특성은 주로 큰 비표면적에 기인한다고 믿어집니다.따라서 필연적으로 문제는 입자 크기, 표면 코팅 또는 응집과 같은 이 핵심 기능에 영향을 미치는 모든 프로세스가 특정 응용 분야에 중요한 나노 입자의 특성을 심각하게 손상시킬 것인지 여부입니다.
입자 크기와 안정제의 영향은 문헌에 비교적 잘 문서화되어 있는 주제입니다.예를 들어, 일반적으로 받아들여지는 견해는 더 작은 나노입자가 더 큰 나노입자보다 독성이 더 크다는 것입니다.2 일반 문헌과 일치하게, 우리의 이전 연구는 포유동물 세포와 미생물에 대한 나노은의 크기 의존적 활성을 입증했습니다.3-5 표면 코팅은 나노물질의 특성에 광범위한 영향을 미치는 또 다른 속성입니다.동일한 나노물질이라도 표면에 안정제를 첨가하거나 변형하는 것만으로도 전혀 다른 물리적, 화학적, 생물학적 특성을 가질 수 있습니다.캡핑제의 적용은 나노입자 합성의 일부로 가장 자주 수행됩니다.예를 들어, 구연산염으로 종결된 은 나노입자는 연구에서 가장 관련성이 높은 AgNP 중 하나이며, 반응 매질로 선택된 안정제 용액에서 은염을 환원시켜 합성됩니다.6 구연산염은 낮은 비용, 가용성, 생체 적합성 및 은에 대한 강한 친화성을 쉽게 활용할 수 있으며, 이는 가역적 표면 흡착에서 이온 상호 작용에 이르기까지 제안된 다양한 상호 작용에 반영될 수 있습니다.구연산염, 중합체, 고분자 전해질 및 생물학적 제제와 같은 7,8 근처의 소분자 및 다원자 이온도 일반적으로 은나노를 안정화하고 고유한 기능화를 수행하는 데 사용됩니다.9-12
의도적인 표면 캡핑을 통해 나노입자의 활성을 변경할 가능성은 매우 흥미로운 영역이지만, 이 표면 코팅의 주요 역할은 무시할 수 있으며 나노입자 시스템에 콜로이드 안정성을 제공합니다.나노물질의 큰 비표면적은 큰 표면 에너지를 생성하여 시스템의 열역학적 능력이 최소 에너지에 도달하는 것을 방해합니다.13 적절한 안정화가 이루어지지 않으면 나노물질의 응집이 발생할 수 있습니다.응집은 분산된 입자가 만날 때 발생하는 다양한 모양과 크기의 입자 집합체의 형성이며 현재의 열역학적 상호 작용으로 인해 입자가 서로 접착됩니다.따라서 안정제는 열역학적 인력에 대응하기 위해 입자 사이에 충분히 큰 반발력을 도입하여 응집을 방지하는 데 사용됩니다.14
나노입자에 의해 유발되는 생물학적 활동의 조절과 관련하여 입자 크기 및 표면 적용 범위에 대한 주제가 철저히 조사되었지만 입자 응집은 크게 무시되는 영역입니다.생물학적으로 관련된 조건에서 나노입자의 콜로이드 안정성을 해결하기 위한 철저한 연구는 거의 없습니다.10,15-17 또한, 이러한 기여는 혈관 혈전증과 같은 부작용이나 독성과 같은 원하는 특성의 상실을 유발할 수 있더라도 응집과 관련된 독성도 연구된 경우 특히 드뭅니다. 그림 1.18, 19에 표시되어 있습니다.사실, 은 나노입자 저항성의 몇 가지 알려진 메커니즘 중 하나는 응집과 관련이 있는데, 그 이유는 특정 대장균(E. coli) 및 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 균주가 플라젤린(flagellin) 단백질을 발현함으로써 나노은 민감도를 감소시키는 것으로 보고되었기 때문입니다.은과의 친화력이 높아 응집을 유도합니다.20
은 나노입자의 독성과 관련된 여러 메커니즘이 있으며, 응집은 이러한 모든 메커니즘에 영향을 미칩니다.AgNP의 생물학적 활동에 대해 가장 많이 논의되는 방법(때때로 "트로이 목마" 메커니즘이라고도 함)은 AgNP를 Ag+ 운반체로 간주합니다.1,21 트로이 목마 메커니즘은 국소 Ag+ 농도의 큰 증가를 보장할 수 있으며, 이는 ROS 생성 및 막 탈분극으로 이어집니다.22-24 응집은 Ag+의 방출에 영향을 주어 독성에 영향을 미칠 수 있습니다. 왜냐하면 은 이온이 산화되고 용해될 수 있는 효과적인 활성 표면을 감소시키기 때문입니다.그러나 AgNP는 이온 방출을 통해서만 독성을 나타내는 것은 아닙니다.다양한 크기 및 형태 관련 상호 작용을 고려해야 합니다.그 중 나노입자 표면의 크기와 모양이 결정적인 특징이다.4,25 이러한 메커니즘의 집합은 "유발 독성 메커니즘"으로 분류될 수 있습니다.잠재적으로 세포 소기관을 손상시키고 세포 사멸을 일으킬 수 있는 미토콘드리아 및 표면 막 반응이 많이 있습니다.25-27 집합체의 형성은 자연적으로 생명체가 인식하는 은 함유 물체의 크기와 모양에 영향을 주기 때문에 이러한 상호 작용도 영향을 받을 수 있습니다.
은 나노입자의 응집에 관한 이전 논문에서 우리는 이 문제를 연구하기 위해 화학적 및 체외 생물학적 실험으로 구성된 효과적인 스크리닝 절차를 시연했습니다.19 동적 광산란(DLS)은 재료가 입자 크기와 비슷한 파장에서 광자를 산란시킬 수 있기 때문에 이러한 유형의 검사에 선호되는 기술입니다.액체 매질 내 입자의 브라운 운동 속도는 크기와 관련이 있으므로 산란광 강도의 변화를 사용하여 액체 샘플의 평균 유체역학적 직경(Z-평균)을 결정할 수 있습니다.28 또한, 시료에 전압을 인가함으로써 나노입자의 제타 전위(ζ 전위)를 Z 평균값과 유사하게 측정할 수 있다.13,28 제타 전위의 절대값이 충분히 높으면(일반 지침에 따르면 > ±30mV) 입자 사이에 강한 정전기 반발력이 발생하여 응집을 방해합니다.특징적인 표면 플라즈몬 공명(SPR)은 주로 귀금속 나노입자(주로 Au 및 Ag)에 기인하는 독특한 광학 현상입니다.29​​ 나노 규모에서 이러한 물질의 전자 진동(표면 플라즈몬)을 기반으로 구형 AgNP는 400 nm 근처에서 특징적인 UV-Vis 흡수 피크를 갖는 것으로 알려져 있습니다.30 입자의 강도와 파장 이동은 DLS 결과를 보완하는 데 사용됩니다. 이 방법은 나노입자 응집과 생체분자의 표면 흡착을 감지하는 데 사용될 수 있기 때문입니다.
얻은 정보를 기반으로 AgNP 독성이 (가장 일반적으로 사용되는 요소) 나노입자 농도가 아닌 응집 수준의 함수로 설명되는 방식으로 세포 생존율(MTT) 및 항균 분석이 수행됩니다.이 독특한 방법을 통해 생물학적 활성에서 응집 수준의 중대한 중요성을 입증할 수 있습니다. 예를 들어 구연산염으로 종결된 AgNP는 응집으로 인해 몇 시간 내에 생물학적 활성을 완전히 잃기 때문입니다.19
현재 연구에서 우리는 나노입자 응집에 대한 나노입자 크기의 영향을 연구함으로써 생체 관련 콜로이드의 안정성과 생물학적 활성에 대한 영향에 대한 이전 기여를 크게 확장하는 것을 목표로 합니다.이것은 의심할 여지없이 나노입자에 대한 연구 중 하나입니다.이 문제를 조사하기 위해 종자 매개 성장 방법을 사용하여 세 가지 다른 크기 범위(10, 20 및 50nm)의 구연산염 말단 AgNP를 생산했습니다.6,32가 가장 일반적인 방법 중 하나입니다.의료 응용 분야에서 광범위하고 일상적으로 사용되는 나노 물질의 경우, 나노은의 응집 관련 생물학적 특성의 가능한 크기 의존성을 연구하기 위해 다양한 크기의 구연산염으로 종결된 AgNP가 선택됩니다.다양한 크기의 AgNP를 합성한 후 생성된 샘플을 투과 전자 현미경(TEM)으로 특성화한 다음 앞서 언급한 스크리닝 절차를 사용하여 입자를 검사했습니다.또한, 시험관 내 세포 배양물 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 및 Fetal Bovine Serum(FBS) 존재 하에서 크기 의존적 응집 거동 및 그 거동을 다양한 pH 값, NaCl, 포도당 및 글루타민 농도에서 평가했습니다.세포독성의 특성은 포괄적인 조건에서 결정됩니다.과학적 합의는 일반적으로 더 작은 입자가 바람직하다는 것을 나타냅니다.우리의 조사는 이것이 사실인지 판단하기 위한 화학적, 생물학적 플랫폼을 제공합니다.
Wan 등이 제안한 종자 매개 성장 방법을 사용하여 약간의 조정을 거쳐 크기 범위가 다른 세 개의 은 나노입자를 제조했습니다.6 이 방법은 은 공급원으로 질산은(AgNO3), 환원제로 수소화붕소나트륨(NaBH4), 안정제로 구연산나트륨을 사용하는 화학적 환원을 기반으로 합니다.먼저 구연산나트륨 이수화물(Na3C6H5O7 x 2H2O)로부터 9mM 구연산염 수용액 75mL를 준비하고 70°C로 가열한다.그 후, 1% w/v AgNO3 용액 2 mL를 반응 매질에 첨가한 후, 새로 제조된 나트륨 보로하이드라이드 용액(2 mL 0.1% w/v)을 혼합물에 적가하였다.생성된 황갈색 현탁액을 1시간 동안 격렬하게 교반하면서 70℃로 유지한 후, 실온으로 냉각시켰다.생성된 샘플(이하 AgNP-I)은 다음 합성 단계에서 종자 매개 성장의 기초로 사용됩니다.
중간 크기 입자 현탁액(AgNP-II로 표시됨)을 합성하려면 90mL의 7.6mM 구연산염 용액을 80°C로 가열하고 이를 10mL의 AgNP-I와 혼합한 다음 2mL의 1% w/v AgNO3 용액을 혼합합니다. 1시간 동안 격렬하게 기계적으로 교반한 후, 샘플을 실온으로 냉각시켰다.
가장 큰 입자(AgNP-III)의 경우 동일한 성장 과정을 반복하지만 이 경우 AgNP-II 10mL를 시드 현탁액으로 사용합니다.샘플이 실온에 도달한 후 40°C에서 추가 용매를 추가하거나 증발시켜 총 AgNO3 함량을 기준으로 공칭 Ag 농도를 150ppm으로 설정하고 마지막으로 추가 사용 시까지 4°C에서 보관합니다.
200kV 가속 전압을 갖춘 FEI Tecnai G2 20 X-Twin 투과 전자 현미경(TEM)(FEI Corporate Headquarters, Hillsboro, Oregon, USA)을 사용하여 나노입자의 형태학적 특성을 조사하고 전자 회절(ED) 패턴을 포착합니다.ImageJ 소프트웨어 패키지를 사용하여 최소 15개의 대표 이미지(~750개 입자)를 평가했으며 결과 히스토그램(및 전체 연구의 모든 그래프)은 OriginPro 2018(OriginLab, Northampton, MA, USA) 33, 34에서 생성되었습니다.
샘플의 평균 유체역학적 직경(Z-평균), 제타 전위(ζ-전위) 및 특징적인 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 측정하여 초기 콜로이드 특성을 설명했습니다.샘플의 평균 유체역학적 직경과 제타 전위는 37±0.1°C에서 일회용 접힌 모세관 셀을 사용하여 Malvern Zetasizer Nano ZS 기기(Malvern Instruments, Malvern, UK)로 측정되었습니다.Ocean Optics 355 DH-2000-BAL UV-Vis 분광 광도계 (Halma PLC, Largo, FL, USA)를 사용하여 250-800 nm 범위의 샘플의 UV-Vis 흡수 스펙트럼으로부터 특징적인 SPR 특성을 얻었습니다.
전체 실험 동안 콜로이드 안정성과 관련된 세 가지 측정 유형이 동시에 수행되었습니다.DLS를 사용하여 입자의 평균 유체역학적 직경(Z 평균)과 제타 전위(ζ 전위)를 측정합니다. 왜냐하면 Z 평균은 나노입자 집합체의 평균 크기와 관련이 있고 제타 전위는 시스템의 정전기 반발력을 나타내기 때문입니다. 나노입자 사이의 반데르발스 인력을 상쇄할 만큼 강합니다.측정은 세 번 반복하여 이루어지며 Z 평균과 제타 전위의 표준 편차는 Zetasizer 소프트웨어로 계산됩니다.피크 강도와 파장의 변화가 응집과 표면 상호 작용을 나타낼 수 있기 때문에 입자의 특징적인 SPR 스펙트럼은 UV-Vis 분광법으로 평가됩니다.29,35 실제로 귀금속의 표면 플라즈몬 공명은 매우 영향력이 커서 생체분자 분석의 새로운 방법을 이끌어 냈습니다.29,36,37 실험 혼합물의 AgNPs 농도는 약 10ppm이며, 그 목적은 최대 초기 SPR 흡수 강도를 1로 설정하는 것입니다. 실험은 시간 의존 방식으로 0에서 수행되었습니다.1.5;삼;6;다양한 생물학적 관련 조건에서 12시간 및 24시간.실험을 설명하는 자세한 내용은 이전 작업에서 볼 수 있습니다.19 즉, 다양한 pH 값(3; 5; 7.2 및 9), 서로 다른 염화나트륨(10mM; 50mM; 150mM), 포도당(3.9mM; 6.7mM) 및 글루타민(4mM) 농도, 그리고 또한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)과 Fetal Bovine Serum(FBS)(in water 및 DMEM)을 모델 시스템으로 준비하고 합성된 은 나노입자의 응집 거동에 미치는 영향을 연구했습니다.pH NaCl, 글루코스, 글루타민의 값은 생리학적 농도를 기준으로 평가하며, DMEM, FBS의 양은 전체 in vitro 실험에 사용된 수준과 동일합니다.38-42 모든 측정은 장거리 입자 상호 작용을 제거하기 위해 10mM NaCl의 일정한 배경 염 농도를 사용하여 pH 7.2 및 37°C에서 수행되었습니다(특정 pH 및 NaCl 관련 실험 제외, 이러한 속성은 아래의 변수임). 공부하다).28 다양한 조건의 목록은 표 1에 요약되어 있습니다. †로 표시된 실험은 참조로 사용되었으며 10mM NaCl 및 pH 7.2를 포함하는 샘플에 해당합니다.
인간 전립선암 세포주(DU145)와 불멸화 인간 각질형성세포(HaCaT)는 ATCC(Manassas, VA, USA)에서 입수했습니다.세포는 10% FBS, 2mM L-글루타민, 0.01% 스트렙토마이신 및 0.005%가 보충된 4.5g/L 포도당(Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA)을 함유하는 Dulbecco의 최소 필수 배지 Eagle(DMEM)에서 일상적으로 배양됩니다. 페니실린(미국 미주리주 세인트 루이스 소재 시그마-알드리치).세포를 5% CO2 및 95% 습도의 37°C 인큐베이터에서 배양합니다.
입자 응집으로 인한 AgNP 세포 독성의 변화를 시간 의존적으로 조사하기 위해 2단계 MTT 분석을 수행했습니다.먼저, AgNP-I, AgNP-II 및 AgNP-III로 처리한 후 두 세포 유형의 생존율을 측정했습니다.이를 위해 두 가지 유형의 세포를 96웰 플레이트에 10,000개 세포/웰의 밀도로 시딩하고 둘째 날에 농도가 증가하는 세 가지 다른 크기의 은 나노입자로 처리했습니다.24시간 처리 후, 세포를 PBS로 세척하고 배양 배지에 희석된 0.5 mg/mL MTT 시약(SERVA, Heidelberg, Germany)과 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.포르마잔 결정을 DMSO(Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA)에 용해시킨 후 Synergy HTX 플레이트 판독기(BioTek-Hungary, 부다페스트, 헝가리)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정했습니다.미처리 대조 시료의 흡수율을 100% 생존율로 간주한다.4개의 독립적인 생물학적 복제를 사용하여 최소 3번의 실험을 수행하십시오.IC50은 활력 결과에 기초한 용량 반응 곡선으로부터 계산됩니다.
이후 두 번째 단계에서는 세포 처리 전 입자를 서로 다른 시간(0, 1.5, 3, 6, 12, 24시간) 동안 150mM NaCl과 함께 배양하여 서로 다른 응집 상태의 은나노입자를 생성했다.이어서, 입자 응집에 의해 영향을 받는 세포 생존력의 변화를 평가하기 위해 이전에 설명한 것과 동일한 MTT 분석을 수행했습니다.GraphPad Prism 7을 사용하여 최종 결과를 평가하고, unpaired t-test로 실험의 통계적 유의성을 계산하고, 그 수준을 * (p ≤ 0.05), ** (p ≤ 0.01), *** (p ≤ 0.001)로 표시합니다. ) 및 ****(p ≤ 0.0001).
Cryptococcus neoformans IFM 5844(IFM; 치바 대학 병원성 진균 및 미생물 독성학 연구 센터) 및 Bacillus Test megaterium SZMC 6031에 대한 항균 감수성을 위해 세 가지 다른 크기의 은 나노 입자(AgNP-I, AgNP-II 및 AgNP-III)가 사용되었습니다. (SZMC: Szeged Microbiology Collection) 및 RPMI 1640 배지(Sigma-Aldrich Co.)의 E. coli SZMC 0582.입자의 응집으로 인한 항균 활성의 변화를 평가하기 위해 먼저 96-well microtiter plate에서 미세희석법으로 최소억제농도(MIC)를 측정하였다.표준화된 세포현탁액(RPMI 1640 배지의 경우 5×104cells/mL) 50μL에 은나노입자 현탁액 50μL를 첨가하고 농도를 2배로 연속 희석한다(전술한 배지에서는 범위가 0~75ppm, 즉, 대조 샘플에는 50 μL의 세포 현탁액과 50 μL의 나노입자가 없는 배지가 포함되어 있습니다.그 후, 플레이트를 30℃에서 48시간 동안 배양하고, SPECTROstar Nano 플레이트 리더기(BMG LabTech, Offenburg, Germany)를 사용하여 배양액의 광학 밀도를 620 nm에서 측정하였다.실험은 세 번 반복하여 수행되었습니다.
이때 단일 응집된 나노입자 샘플 50 μL를 사용한 것을 제외하고는 앞서 설명한 것과 동일한 과정을 사용하여 앞서 언급한 균주에 대한 응집이 항균 활성에 미치는 영향을 조사했습니다.은 나노입자의 다양한 응집 상태는 세포 처리 전 입자를 다양한 기간(0, 1.5, 3, 6, 12 및 24시간) 동안 150mM NaCl과 함께 배양하여 생성됩니다.성장 조절로는 RPMI 1640 배지 50μL를 첨가한 현탁액을 사용하였고, 독성 조절을 위해 나노입자가 응집되지 않은 현탁액을 사용하였다.실험은 세 번 반복하여 수행되었습니다.MTT 분석과 동일한 통계 분석을 사용하여 GraphPad Prism 7을 사용하여 최종 결과를 다시 평가하십시오.
가장 작은 입자(AgNP-I)의 응집 수준이 특성화되었으며 그 결과는 이전 연구에서 부분적으로 발표되었지만 더 나은 비교를 위해 모든 입자를 철저히 스크리닝했습니다.실험 데이터는 다음 섹션에서 수집되고 논의됩니다.세 가지 크기의 AgNP.19
TEM, UV-Vis 및 DLS에 의해 수행된 측정은 모든 AgNP 샘플의 성공적인 합성을 확인했습니다(그림 2A-D).그림 2의 첫 번째 행에 따르면 가장 작은 입자(AgNP-I)는 평균 직경이 약 10 nm인 균일한 구형 형태를 나타냅니다.종자 매개 성장 방법은 또한 평균 입자 직경이 각각 약 20 nm 및 50 nm인 다양한 크기 범위의 AgNP-II 및 AgNP-III를 제공합니다.입자 분포의 표준 편차에 따르면 세 샘플의 크기가 겹치지 않으며 이는 비교 분석에 중요합니다.TEM 기반 입자 2D 투영의 평균 종횡비와 두께 비율을 비교하여 입자의 구형도가 ImageJ의 모양 필터 플러그인(그림2E)에 의해 평가된다고 가정합니다.43 입자의 형상 분석에 따르면 입자의 종횡비(가장 작은 경계 직사각형의 큰 변/짧은 변)는 입자 성장에 영향을 받지 않으며, 입자의 얇음 비율(해당 완전원의 측정 면적/이론적 면적)은 ) 점차적으로 감소합니다.이로 인해 이론적으로 완벽하게 둥근 모양의 다면체 입자가 점점 더 많이 생성되며, 이는 두께 비율 1에 해당합니다.
그림 2 투과 전자 현미경(TEM) 이미지(A), 전자 회절(ED) 패턴(B), 크기 분포 히스토그램(C), 특성 자외선-가시선(UV-Vis) 광 흡수 스펙트럼(D) 및 평균 유체 구연산염 - 기계적 직경(Z-평균), 제타 전위, 종횡비 및 두께 비율(E)을 갖는 말단형 은 나노입자는 세 가지 다른 크기 범위를 갖습니다. AgNP-I은 10 nm(맨 위 줄), AgNP -II는 20 nm(가운데 줄) ), AgNP-III(맨 아래 줄)은 50 nm입니다.
성장 방법의 순환 특성이 입자 모양에 어느 정도 영향을 미쳐 더 큰 AgNP의 구형도가 작아졌지만 세 샘플 모두 준구형으로 유지되었습니다.또한, 그림 2B의 전자회절 패턴에서 볼 수 있듯이 나노입자의 결정성은 영향을 받지 않습니다.은의 (111), (220), (200) 및 (311) 밀러 지수와 상관관계가 있을 수 있는 눈에 띄는 회절 고리는 과학 문헌 및 이전 기여와 매우 일치합니다.9, 19,44 AgNP-II와 AgNP-III의 Debye-Scherrer 고리의 단편화는 ED 이미지가 동일한 배율로 캡처되므로 입자 크기가 증가할수록 회절된 입자의 수가 증가하기 때문입니다. 단위 면적은 증가하고 감소합니다.
나노입자의 크기와 모양은 생물학적 활동에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다.3,45 모양 의존적 촉매 및 생물학적 활성은 서로 다른 모양이 특정 결정면(다른 밀러 지수를 가짐)을 증식시키는 경향이 있고 이러한 결정면이 서로 다른 활성을 갖는다는 사실로 설명할 수 있습니다.45,46 준비된 입자는 매우 유사한 결정 특성에 해당하는 유사한 ED 결과를 제공하므로 후속 콜로이드 안정성 및 생물학적 활성 실험에서 관찰된 모든 차이는 모양 관련 특성이 아닌 나노입자 크기에 기인한다고 가정할 수 있습니다.
그림 2D에 요약된 UV-Vis 결과는 합성된 AgNP의 압도적인 구형 특성을 더욱 강조합니다. 왜냐하면 세 샘플 모두의 SPR 피크가 구형 은 나노입자의 특징적인 값인 약 400nm이기 때문입니다.29,30 캡처된 스펙트럼은 또한 나노은의 성공적인 종자 매개 성장을 확인했습니다.입자 크기가 증가함에 따라 AgNP-II의 최대 광 흡수에 해당하는 파장이 - 더욱 두드러지게 - 문헌에 따르면 AgNP-III는 적색편이를 경험했습니다.6,29
AgNP 시스템의 초기 콜로이드 안정성과 관련하여 DLS를 사용하여 pH 7.2에서 입자의 평균 유체역학적 직경과 제타 전위를 측정했습니다.그림 2E에 묘사된 결과는 AgNP-III가 AgNP-I 또는 AgNP-II보다 콜로이드 안정성이 더 높다는 것을 보여줍니다. 이는 일반적인 지침에 따르면 장기간 콜로이드 안정성을 위해서는 절대 30mV의 제타 전위가 필요하다는 것을 나타냅니다. 이 발견은 다음과 같은 경우에 추가로 뒷받침됩니다. Z 평균 값(자유 입자와 응집 입자의 평균 유체역학적 직경으로 구함)은 TEM으로 구한 1차 입자 크기와 비교됩니다. 두 값이 가까울수록 샘플에 집적되는 정도가 더 온화하기 때문입니다.실제로 AgNP-I 및 AgNP-II의 Z 평균은 주요 TEM으로 평가된 입자 크기보다 상당히 높으므로 AgNP-III와 비교하여 이러한 샘플은 응집될 가능성이 더 높을 것으로 예측됩니다. 가까운 크기의 Z 평균값이 동반됩니다.
이 현상에 대한 설명은 두 가지로 나눌 수 있습니다.한편, 구연산염 농도는 모든 합성 단계에서 유사한 수준으로 유지되어 상대적으로 높은 양의 하전된 표면 그룹을 제공하여 성장하는 입자의 비표면적이 감소하는 것을 방지합니다.그러나 Levak 등에 따르면 구연산염과 같은 작은 분자는 나노입자 표면의 생체분자에 의해 쉽게 교환될 수 있다고 합니다.이 경우 콜로이드 안정성은 생성된 생체분자의 코로나에 의해 결정됩니다.31 이러한 행동은 우리의 집계 측정에서도 관찰되었기 때문에(나중에 더 자세히 논의됨), 구연산염 상한만으로는 이 현상을 설명할 수 없습니다.
반면, 입자 크기는 나노미터 수준의 응집 경향에 반비례합니다.이는 입자 인력이 입자 사이의 인력과 척력의 합으로 설명되는 전통적인 Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek(DLVO) 방법에 의해 주로 뒷받침됩니다.He et al.에 따르면, 적철광 나노입자 내 나노입자의 크기에 따라 DLVO 에너지 곡선의 최대값이 감소하여 최소 1차 에너지에 도달하기 쉬워져 비가역적인 응집(응축)을 촉진한다고 한다.47 그러나 DLVO 이론의 한계를 넘어서는 다른 측면도 있을 것으로 추측된다.반 데르 발스 중력과 정전기 이중층 반발력은 입자 크기가 증가함에 따라 유사하지만 Hotze et al.DLVO가 허용하는 것보다 집합에 더 강력한 영향을 미친다고 제안합니다.14 그들은 나노입자의 표면 곡률이 더 이상 평평한 표면으로 추정될 수 없어 수학적 추정이 적용 불가능하다고 믿습니다.또한, 입자 크기가 감소함에 따라 표면에 존재하는 원자의 비율이 높아져 전자 구조 및 표면 전하 거동이 발생합니다.그리고 표면 반응성이 변화하여 전기 이중층의 전하가 감소하고 응집이 촉진될 수 있습니다.
그림 3에서 AgNP-I, AgNP-II 및 AgNP-III의 DLS 결과를 비교할 때 세 샘플 모두 유사한 pH 프롬프트 응집을 나타냄을 관찰했습니다.강한 산성 환경(pH 3)은 시료의 제타 전위를 0mV로 이동시켜 입자가 미크론 크기의 응집체를 형성하게 하는 반면, 알칼리성 pH는 제타 전위를 더 큰 음수 값으로 이동시켜 입자가 더 작은 응집체(pH 5)를 형성하게 합니다. ).및 7.2)), 또는 완전히 응집되지 않은 상태로 유지됩니다(pH 9).다양한 샘플 간의 몇 가지 중요한 차이점도 관찰되었습니다.실험 전반에 걸쳐 AgNP-I는 pH에 의해 유발된 제타 전위 변화에 가장 민감한 것으로 입증되었습니다. 왜냐하면 이들 입자의 제타 전위는 pH 9에 비해 pH 7.2에서 감소한 반면 AgNP-II 및 AgNP-III는 A만 나타냈기 때문입니다. ζ의 상당한 변화는 pH 3 부근에서 나타납니다. 또한 AgNP-II는 더 느린 변화와 중간 정도의 제타 전위를 보인 반면, AgNP-III는 세 가지 중 가장 온화한 동작을 보였는데, 이는 시스템이 가장 높은 절대 제타 값과 느린 추세 이동을 보여주었기 때문입니다. AgNP-III pH 유발 응집에 대한 저항성이 가장 높습니다.이러한 결과는 평균 유체역학적 직경 측정 결과와 일치합니다.이들 프라이머의 입자 크기를 고려할 때, AgNP-I는 모든 pH 값에서 일정하고 점진적인 응집을 나타냈는데, 이는 아마도 10mM NaCl 배경으로 인한 것일 가능성이 크며, AgNP-II 및 AgNP-III는 pH 3에서만 유의미한 응집을 나타냈습니다.가장 흥미로운 차이점은 큰 나노입자 크기에도 불구하고 AgNP-III가 pH 3에서 24시간 동안 가장 작은 응집체를 형성하여 항응집 특성을 강조한다는 것입니다.24시간 후 pH 3에서 AgNP의 평균 Z를 제조된 샘플의 값으로 나누면 AgNP-I 및 AgNP-II의 상대적 응집체 크기가 50배, 42배, 22배 증가한 것을 관찰할 수 있습니다. , 각각.III.
그림 3 크기가 증가하는(10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II 및 50 nm: AgNP-III) 시트레이트 말단 은 나노입자 샘플의 동적 광산란 결과는 평균 유체역학적 직경(Z 평균)으로 표시됩니다. ) (오른쪽) 다양한 pH 조건에서 제타 전위(왼쪽)가 24시간 이내에 변경됩니다.
관찰된 pH 의존적 응집은 UV-Vis 스펙트럼에서 알 수 있듯이 AgNP 샘플의 특징적인 표면 플라즈몬 공명(SPR)에도 영향을 미쳤습니다.보충 그림 S1에 따르면, 3개의 은 나노입자 현탁액이 모두 응집된 후 SPR 피크의 강도가 감소하고 적당한 적색 이동이 나타납니다.pH의 함수로서 이러한 변화의 정도는 DLS 결과에 의해 예측된 응집 정도와 일치하지만 몇 가지 흥미로운 경향이 관찰되었습니다.직관과는 달리 중간 크기의 AgNP-II가 SPR 변화에 가장 민감한 반면, 다른 두 샘플은 덜 민감한 것으로 나타났습니다.SPR 연구에서 50 nm는 이론적 입자 크기 제한으로, 유전 특성을 기준으로 입자를 구별하는 데 사용됩니다.50nm보다 작은 입자(AgNP-I 및 AgNP-II)는 단순한 유전 쌍극자로 설명할 수 있는 반면, 이 한계에 도달하거나 초과하는 입자(AgNP-III)는 더 복잡한 유전 특성을 가지며 공명 밴드는 다중 모드 변화로 분할됩니다. .두 개의 더 작은 입자 샘플의 경우 AgNP는 단순한 쌍극자로 간주될 수 있으며 플라즈마가 쉽게 겹칠 수 있습니다.입자 크기가 증가함에 따라 이러한 결합은 본질적으로 더 큰 플라즈마를 생성하며, 이는 관찰된 더 높은 감도를 설명할 수 있습니다.29 그러나 가장 큰 입자의 경우, 다른 결합 상태가 발생할 수 있는 경우 단순 쌍극자 추정은 유효하지 않으며, 이는 스펙트럼 변화를 나타내는 AgNP-III의 감소 경향을 설명할 수 있습니다.29
우리의 실험 조건에서 pH 값은 다양한 크기의 구연산염으로 코팅된 은 나노입자의 콜로이드 안정성에 중대한 영향을 미친다는 것이 입증되었습니다.이러한 시스템에서는 AgNP 표면의 음전하를 띤 -COO- 그룹에 의해 안정성이 제공됩니다.구연산염 이온의 카르복실산염 작용기는 다수의 H+ 이온에서 양성자화되어 생성된 카르복실기는 그림 4의 맨 윗줄과 같이 더 이상 입자 사이의 정전기적 반발력을 제공할 수 없습니다. 르 샤틀리에의 원리에 따르면 AgNP는 샘플은 pH 3에서 빠르게 응집되지만 pH가 증가함에 따라 점차적으로 더욱 안정해집니다.
그림 4 다양한 pH(맨 위 행), NaCl 농도(가운데 행) 및 생체분자(맨 아래 행)에서 응집으로 정의된 표면 상호 작용의 도식적 메커니즘.
그림 5에 따르면, 다양한 크기의 AgNP 현탁액의 콜로이드 안정성도 증가하는 염분 농도에서 조사되었습니다.제타 전위에 기초하여, 이러한 구연산염으로 종결된 AgNP 시스템에서 증가된 나노입자 크기는 다시 NaCl의 외부 영향에 대한 향상된 저항을 제공합니다.AgNP-I에서는 10mM NaCl이면 가벼운 응집을 유도하기에 충분하며 50mM의 염 농도는 매우 유사한 결과를 제공합니다.AgNP-II 및 AgNP-III에서는 10mM NaCl의 값이 (AgNP-II) 또는 (AgNP-III) -30mV 이하로 유지되기 때문에 제타 전위에 큰 영향을 미치지 않습니다.NaCl 농도를 50mM, 최종적으로 150mM NaCl로 늘리면 모든 샘플에서 제타 전위의 절대값을 크게 줄일 수 있지만 입자가 클수록 더 많은 음전하를 유지합니다.이러한 결과는 AgNP의 예상 평균 유체역학적 직경과 일치합니다.10, 50 및 150mM NaCl에서 측정된 Z 평균 추세선은 서로 다르며 점차 증가하는 값을 나타냅니다.마지막으로 세 번의 150mM 실험 모두에서 마이크론 크기의 응집체가 검출되었습니다.
그림 5 크기가 증가하는(10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II 및 50 nm: AgNP-III) 구연산염으로 종결된 은 나노입자 샘플의 동적 광산란 결과는 평균 유체역학적 직경(Z 평균)으로 표시됩니다. )(오른쪽)과 제타 전위(왼쪽)는 다양한 NaCl 농도에서 24시간 이내에 변화합니다.
보충 그림 S2의 UV-Vis 결과는 세 샘플 모두에서 50mM 및 150mM NaCl의 SPR이 즉각적이고 크게 감소함을 보여줍니다.이는 DLS로 설명할 수 있는데, 이는 NaCl 기반 응집이 pH 의존적 실험보다 빠르게 발생하기 때문이며, 이는 초기(0, 1.5, 3시간) 측정 간의 큰 차이로 설명됩니다.또한 염 농도를 높이면 실험 매체의 상대 유전율도 증가하여 표면 플라즈몬 공명에 큰 영향을 미칩니다.29
NaCl의 효과는 그림 4의 가운데 줄에 요약되어 있습니다. 일반적으로 염화나트륨의 농도를 높이면 산도가 증가하는 것과 유사한 효과가 있다고 결론을 내릴 수 있습니다. 왜냐하면 Na+ 이온은 카르복실산 그룹 주위에 배위하는 경향이 있기 때문입니다. 음의 제타 전위 AgNP를 억제합니다.또한, 150mM NaCl은 세 가지 샘플 모두에서 미크론 크기의 응집체를 생성했는데, 이는 생리학적 전해질 농도가 구연산염으로 종결된 AgNP의 콜로이드 안정성에 해롭다는 것을 나타냅니다.유사한 AgNP 시스템에서 NaCl의 임계 응축 농도(CCC)를 고려함으로써 이러한 결과를 관련 문헌에 영리하게 배치할 수 있습니다.Huynhet al.El Badawy et al.구연산염 코팅이 된 10nm AgNP의 CCC는 70mM인 것으로 관찰되었습니다.10,16 또한 He 등은 약 300mM의 상당히 높은 CCC를 측정했는데, 이로 인해 합성 방법이 이전에 언급한 논문과 다르다.48 현재 기여가 이러한 값에 대한 포괄적인 분석을 목표로 하는 것은 아니지만, 전체 연구의 복잡성에서 우리의 실험 조건이 증가하고 있기 때문에 생물학적으로 관련된 NaCl 농도인 50mM, 특히 150mM NaCl은 상당히 높은 것으로 보입니다.응고가 유도되어 감지된 강한 변화를 설명합니다.
중합 실험의 다음 단계는 간단하지만 생물학적으로 관련된 분자를 사용하여 나노입자-생체 분자 상호 작용을 시뮬레이션하는 것입니다.DLS(그림 6 및 7) 및 UV-Vis 결과(보조 그림 S3 및 S4)를 기반으로 몇 가지 일반적인 결론을 내릴 수 있습니다.실험 조건에서 연구된 분자 포도당과 글루타민은 AgNP 시스템에서 응집을 유도하지 않습니다. 왜냐하면 Z-평균 추세가 해당 기준 측정 값과 밀접하게 관련되어 있기 때문입니다.이들의 존재가 응집에 영향을 미치지는 않지만 실험 결과에 따르면 이들 분자는 AgNP 표면에 부분적으로 흡착되는 것으로 나타났습니다.이 견해를 뒷받침하는 가장 눈에 띄는 결과는 빛 흡수의 관찰된 변화입니다.AgNP-I는 의미 있는 파장이나 강도 변화를 나타내지 않지만 더 큰 입자를 측정하면 더 명확하게 관찰할 수 있는데, 이는 앞서 언급한 더 큰 광학 감도 때문일 가능성이 높습니다.농도에 관계없이 포도당은 대조 측정에 비해 1.5시간 후에 더 큰 적색 편이를 일으킬 수 있는데, 이는 AgNP-II에서 약 40nm, AgNP-III에서 약 10nm로 표면 상호 작용의 발생을 입증합니다.글루타민도 비슷한 경향을 보였지만 그 변화는 그리 뚜렷하지 않았습니다.또한, 글루타민이 중간 및 큰 입자의 절대 제타 전위를 감소시킬 수 있다는 점도 언급할 가치가 있습니다.그러나 이러한 제타 변화는 응집 수준에 영향을 미치지 않는 것으로 보이므로 글루타민과 같은 작은 생체분자라도 입자 사이에 어느 정도 공간적 반발력을 제공할 수 있다고 추측할 수 있습니다.
그림 6 크기가 증가하는(10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II 및 50 nm: AgNP-III) 시트레이트 말단 은 나노입자 샘플의 동적 광산란 결과는 평균 유체역학적 직경(Z 평균)으로 표시됩니다. (오른쪽) 다양한 포도당 농도의 외부 조건에서 제타 전위(왼쪽)는 24시간 이내에 변경됩니다.
그림 7 크기가 증가하는(10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II 및 50 nm: AgNP-III) 시트레이트 말단 은 나노입자 샘플의 동적 광산란 결과는 평균 유체역학적 직경(Z 평균)으로 표시됩니다. ) (오른쪽) 글루타민이 있는 경우 제타 전위(왼쪽)는 24시간 이내에 변화합니다.
간단히 말해서, 포도당 및 글루타민과 같은 작은 생체 분자는 측정된 농도에서 콜로이드 안정성에 영향을 미치지 않습니다. 제타 전위 및 UV-Vis 결과에 다양한 정도로 영향을 주지만 Z 평균 결과는 일관되지 않습니다.이는 분자의 표면 흡착이 정전기적 반발력을 억제하면서도 동시에 치수 안정성을 제공한다는 것을 나타냅니다.
이전 결과를 이전 결과와 연결하고 생물학적 조건을 보다 능숙하게 시뮬레이션하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 세포 배양 구성 요소 중 일부를 선택하여 AgNP 콜로이드의 안정성을 연구하기 위한 실험 조건으로 사용했습니다.전체 in vitro 실험에 있어서 배지로서 DMEM의 가장 중요한 기능 중 하나는 필요한 삼투압 조건을 확립하는 것이지만, 화학적 관점에서 보면 총 이온세기가 150mM NaCl과 유사한 복합염용액이다. .40 FBS의 경우, 표면 흡착의 관점에서 생체분자(주로 단백질)의 복잡한 혼합물이며 화학적 조성과 다양성에도 불구하고 포도당과 글루타민의 실험 결과와 일부 유사성을 가지고 있습니다. 성별은 훨씬 더 복잡합니다.DLS 및 UV - 각각 그림 8과 보충 그림 S5에 표시된 가시적 결과는 이들 재료의 화학적 조성을 조사하고 이를 이전 섹션의 측정값과 연관시켜 설명할 수 있습니다.
그림 8 크기가 증가하는(10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II 및 50 nm: AgNP-III) 시트레이트 말단 은 나노입자 샘플의 동적 광산란 결과는 평균 유체역학적 직경(Z 평균)으로 표시됩니다. ) (오른쪽) 세포 배양 성분인 DMEM과 FBS가 있는 경우 제타 전위(왼쪽)가 24시간 이내에 변화합니다.
DMEM에서 다양한 크기의 AgNP를 희석하면 높은 NaCl 농도에서 관찰되는 것과 콜로이드 안정성에 유사한 효과가 있습니다.50 v/v% DMEM에 AgNP를 분산시킨 결과, 제타 전위와 Z-평균 값이 증가하고 SPR 강도가 급격히 감소하면서 대규모 응집이 감지되는 것으로 나타났습니다.24시간 후 DMEM에 의해 유도된 최대 응집체 크기는 프라이머 나노입자의 크기에 반비례한다는 점은 주목할 가치가 있습니다.
FBS와 AgNP 사이의 상호작용은 포도당, 글루타민과 같은 더 작은 분자가 존재할 때 관찰되는 것과 유사하지만 그 효과는 더욱 강력합니다.입자의 Z 평균은 영향을 받지 않은 채로 유지되지만 제타 전위의 증가가 감지됩니다.SPR 피크는 약간의 적색 이동을 보였지만 더 흥미롭게도 SPR 강도는 대조 측정에서만큼 크게 감소하지 않았습니다.이러한 결과는 나노입자 표면의 거대분자의 선천적인 흡착으로 설명될 수 있으며(그림 4의 아래쪽 줄), 이는 이제 신체 내 생체분자 코로나의 형성으로 이해됩니다.49