Javascript зараз вимкнено у вашому браузері.Якщо javascript вимкнено, деякі функції цього сайту не працюватимуть.
Зареєструйте ваші конкретні дані та конкретні препарати, які вас цікавлять, і ми зіставимо надану вами інформацію зі статтями в нашій великій базі даних і своєчасно надішлемо вам PDF-копію електронною поштою.
Чи завжди менші наночастинки кращі?Зрозуміти біологічні ефекти залежної від розміру агрегації наночастинок срібла в біологічно відповідних умовах
Автори: Bélteky P, Rónavári A, Zakupszky D, Boka E, Igaz N, Szerencsés B, Pfeiffer I, Vágvölgyi C, Kiricsi M, Kónya Z
Péter Bélteky,1,* Andrea Rónavári,1,* Dalma Zakupszky,1 Eszter Boka,1 Nóra Igaz,2 Bettina Szerencsés,3 Ilona Pfeiffer,3 Csaba Vágvölgyi,3 Mónika Kiricsi з хімії навколишнього середовища, Угорщина, Угорський факультет науки та інформатики , Сегедський університет;2 кафедра біохімії та молекулярної біології, факультет науки та інформації, Сегедський університет, Угорщина;3 кафедра мікробіології, факультет науки та інформації, Сегедський університет, Угорщина;Дослідницька група 4MTA-SZTE Reaction Kinetics and Surface Chemistry Group, Сегед, Угорщина* Ці автори внесли однакову частку в цю роботу.Зв’язок: Zoltán Kónya Department of Applied and Environment Chemistry, Faculty of Science and Informatics, University of Szeged, Rerrich Square 1, Szeged, H-6720, Hungary Телефон +36 62 544620 Електронна пошта [Захист електронної пошти] Мета: наночастинки срібла (AgNP) один із найбільш досліджуваних наноматеріалів, особливо завдяки їх біомедичному застосуванню.Однак через агрегацію наночастинок їх чудова цитотоксичність і антибактеріальна активність часто порушуються в біологічних середовищах.У цій роботі було вивчено агрегаційну поведінку та відповідну біологічну активність трьох різних зразків наночастинок срібла з кінцевим цитратом із середнім діаметром 10, 20 та 50 нм.Метод: Використовуйте трансмісійний електронний мікроскоп для синтезу та характеристики наночастинок, оцініть їх агрегаційну поведінку за різних значень рН, концентрацій NaCl, глюкози та глутаміну за допомогою динамічного розсіювання світла та ультрафіолетової видимої спектроскопії.Крім того, такі компоненти клітинного культурального середовища, як Dulbecco, покращують агрегаційну поведінку в Eagle Medium і Fetal Calf Serum.Результати: Результати показують, що кислий рН і фізіологічний вміст електролітів зазвичай індукують агрегацію мікронного масштабу, яка може бути опосередкована утворенням біомолекулярної корони.Варто відзначити, що більші частинки виявляють більшу стійкість до зовнішніх впливів, ніж їх менші побратими.Випробування на цитотоксичність та антибактеріальні випробування in vitro проводили шляхом обробки клітин агрегатами наночастинок на різних стадіях агрегації.Висновок: наші результати показують глибоку кореляцію між колоїдною стабільністю та токсичністю AgNP, оскільки екстремальна агрегація призводить до повної втрати біологічної активності.Вищий ступінь антиагрегації, що спостерігається для більших частинок, має значний вплив на токсичність in vitro, оскільки такі зразки зберігають більшу антимікробну та активність клітин ссавців.Ці висновки дозволяють зробити висновок, що, незважаючи на загальну думку у відповідній літературі, націлювання на найменші можливі наночастинки може бути не найкращим напрямком дій.Ключові слова: опосередкований насінням ріст, колоїдна стабільність, залежна від розміру агрегаційна поведінка, токсичність пошкодження агрегації
Оскільки попит і виробництво наноматеріалів продовжують зростати, все більше уваги приділяється їх біобезпеці або біологічній активності.Наночастинки срібла (AgNP) є одними з найбільш часто синтезованих, досліджуваних і використовуваних представників цього класу матеріалів завдяки їхнім відмінним каталітичним, оптичним і біологічним властивостям.1 Загальноприйнято вважати, що унікальні характеристики наноматеріалів (включаючи AgNP) в основному пов’язані з їхньою великою питомою поверхнею.Отже, неминучою проблемою є будь-який процес, який впливає на цю ключову характеристику, таку як розмір частинок, покриття поверхні або агрегацію, чи серйозно пошкодить властивості наночастинок, які є критичними для конкретних застосувань.
Вплив розміру частинок і стабілізаторів є предметами, які були відносно добре задокументовані в літературі.Наприклад, загальноприйнятою точкою зору є те, що менші наночастинки більш токсичні, ніж більші наночастинки.2 Відповідно до загальної літератури, наші попередні дослідження продемонстрували залежну від розміру дію наносрібла на клітини ссавців і мікроорганізми.3–5 Поверхневе покриття є ще одним атрибутом, який має великий вплив на властивості наноматеріалів.Просто додаючи або модифікуючи стабілізатори на своїй поверхні, той самий наноматеріал може мати зовсім інші фізичні, хімічні та біологічні властивості.Застосування блокуючих агентів найчастіше виконується в рамках синтезу наночастинок.Наприклад, наночастинки срібла з цитратними кінцями є одними з найбільш релевантних AgNP у дослідженнях, які синтезуються шляхом відновлення солей срібла у вибраному розчині стабілізатора як реакційного середовища.6 Цитрат може легко скористатися перевагами його низької вартості, доступності, біосумісності та сильної спорідненості зі сріблом, що може відображатися в різних запропонованих взаємодіях, від оборотної поверхневої адсорбції до іонних взаємодій.Малі молекули та багатоатомні іони поблизу 7,8, такі як цитрати, полімери, поліелектроліти та біологічні агенти, також зазвичай використовуються для стабілізації наносрібла та виконання унікальних функціональних впливів на нього.9-12
Хоча можливість зміни активності наночастинок шляхом навмисного покриття поверхні є дуже цікавою областю, головна роль цього поверхневого покриття є незначною, забезпечуючи колоїдну стабільність для системи наночастинок.Велика питома поверхня наноматеріалів вироблятиме велику поверхневу енергію, що перешкоджає термодинамічній здатності системи досягати мінімальної енергії.13 Без належної стабілізації це може призвести до агломерації наноматеріалів.Агрегація — це утворення агрегатів частинок різної форми та розміру, яке відбувається, коли дисперговані частинки зустрічаються, а поточні термодинамічні взаємодії дозволяють частинкам злипатися одна з одною.Тому стабілізатори використовуються для запобігання агрегації шляхом введення досить великої сили відштовхування між частинками для протидії їх термодинамічному притяганню.14
Незважаючи на те, що питання розміру частинок і покриття поверхні було ретельно вивчено в контексті його регулювання біологічної активності, викликаної наночастинками, агрегація частинок є областю, в основному занедбаною.Майже немає ґрунтовних досліджень колоїдної стабільності наночастинок у біологічно відповідних умовах.10,15-17 Крім того, цей внесок є особливо рідкісним, коли токсичність, пов’язана з агрегацією, також вивчалася, навіть якщо вона може викликати побічні реакції, такі як тромбоз судин, або втрату бажаних характеристик, таких як його токсичність, як показано на рисунку 1.18, 19 показано.Фактично, один із небагатьох відомих механізмів стійкості до наночастинок срібла пов’язаний з агрегацією, оскільки, як повідомляється, деякі штами E. coli та Pseudomonas aeruginosa знижують свою чутливість до наносрібла шляхом експресії білка флагеліну, flagellin.Він має високу спорідненість до срібла, тим самим викликаючи агрегацію.20
Існує кілька різних механізмів, пов’язаних з токсичністю наночастинок срібла, і агрегація впливає на всі ці механізми.Найбільш обговорюваний метод біологічної активності AgNP, який іноді називають механізмом «троянського коня», розглядає AgNP як носії Ag+.1,21 Механізм троянського коня може забезпечити значне підвищення локальної концентрації Ag+, що призводить до генерації АФК і деполяризації мембрани.22-24 Агрегація може впливати на вивільнення Ag+, тим самим впливаючи на токсичність, оскільки вона зменшує ефективну активну поверхню, де іони срібла можуть окислюватися та розчинятися.Однак AgNPs не лише виявлятимуть токсичність через вивільнення іонів.Необхідно враховувати багато взаємодій, пов’язаних із розміром і морфологією.Серед них розмір і форма поверхні наночастинок є визначальними характеристиками.4,25 Сукупність цих механізмів можна класифікувати як «механізми індукованої токсичності».Існує потенційно багато мітохондріальних і поверхневих мембранних реакцій, які можуть пошкодити органели та спричинити загибель клітин.25-27 Оскільки утворення агрегатів природним чином впливає на розмір і форму об’єктів, що містять срібло, які розпізнаються живими системами, ці взаємодії також можуть бути порушені.
У нашій попередній статті про агрегацію наночастинок срібла ми продемонстрували ефективну процедуру скринінгу, що складається з хімічних та біологічних експериментів in vitro для вивчення цієї проблеми.19 Динамічне розсіювання світла (DLS) є кращою технікою для цих типів перевірок, оскільки матеріал може розсіювати фотони на довжині хвилі, порівнянній з розміром його частинок.Оскільки швидкість броунівського руху частинок у рідкому середовищі пов’язана з розміром, зміна інтенсивності розсіяного світла може бути використана для визначення середнього гідродинамічного діаметра (Z-середнє) рідкого зразка.28 Крім того, прикладаючи напругу до зразка, дзета-потенціал (ζ-потенціал) наночастинки можна виміряти подібно до середнього значення Z.13,28 Якщо абсолютне значення дзета-потенціалу достатньо високе (відповідно до загальних вказівок> ±30 мВ), це призведе до сильного електростатичного відштовхування між частинками, щоб протидіяти агрегації.Характерний поверхневий плазмонний резонанс (SPR) — це унікальне оптичне явище, яке в основному пов’язане з наночастинками дорогоцінних металів (переважно Au та Ag).29​​ На основі електронних коливань (поверхневих плазмонів) цих матеріалів на нанорозмірі відомо, що сферичні AgNPs мають характерний пік поглинання УФ-видимого діапазону поблизу 400 нм.30 Інтенсивність і зсув довжини хвилі частинок використовуються для доповнення результатів DLS, оскільки цей метод можна використовувати для виявлення агрегації наночастинок і поверхневої адсорбції біомолекул.
На основі отриманої інформації аналізи життєздатності клітин (MTT) і антибактеріальні аналізи виконуються таким чином, що токсичність AgNP описується як функція рівня агрегації, а не (найчастіше використовуваного фактора) концентрації наночастинок.Цей унікальний метод дозволяє нам продемонструвати глибоку важливість рівня агрегації в біологічній активності, тому що, наприклад, AgNP із цитратним закінченням повністю втрачають свою біологічну активність протягом кількох годин через агрегацію.19
У поточній роботі ми прагнемо значно розширити наш попередній внесок у стабільність біопов’язаних колоїдів та їх вплив на біологічну активність шляхом вивчення впливу розміру наночастинок на агрегацію наночастинок.Це, безсумнівно, одне з досліджень наночастинок.31 Щоб дослідити цю проблему, був використаний метод росту, опосередкованого насінням, для отримання AgNP із цитратним закінченням у трьох різних діапазонах розмірів (10, 20 та 50 нм).6,32 як один із найпоширеніших методів.Для наноматеріалів, які широко та регулярно використовуються в медичних цілях, для вивчення можливої ​​залежності біологічних властивостей наносрібла, пов’язаних із агрегацією, вибираються AgNP із цитратним закінченням різного розміру.Після синтезу AgNP різних розмірів ми охарактеризували отримані зразки за допомогою трансмісійної електронної мікроскопії (ТЕМ), а потім дослідили частинки за допомогою вищезгаданої процедури скринінгу.Крім того, у присутності клітинних культур in vitro, модифікованого середовища Ігла Дульбекко (DMEM) і фетальної бичачої сироватки (FBS), залежну від розміру агрегаційну поведінку та її поведінку оцінювали при різних значеннях pH, NaCl, глюкози та концентраціях глутаміну.Характеристики цитотоксичності визначають у комплексних умовах.Науковий консенсус вказує на те, що загалом кращими є менші частинки;наше дослідження забезпечує хімічну та біологічну платформу, щоб визначити, чи це так.
Три наночастинки срібла з різними діапазонами розмірів були отримані за допомогою методу росту, опосередкованого насінням, запропонованого Wan та ін., з невеликими коригуваннями.6 Цей метод заснований на хімічному відновленні з використанням нітрату срібла (AgNO3) як джерела срібла, боргідриду натрію (NaBH4) як відновника та цитрату натрію як стабілізатора.Спочатку приготуйте 75 мл 9 мМ водного розчину цитрату з дигідрату цитрату натрію (Na3C6H5O7 x 2H2O) і нагрійте до 70°C.Потім до реакційного середовища додавали 2 мл 1% мас./об. розчину AgNO3, а потім в суміш по краплях вливали свіжоприготований розчин борогідриду натрію (2 мл 0,1% мас./об.).Отриману жовто-коричневу суспензію витримували при 70°C при інтенсивному перемішуванні протягом 1 години, а потім охолоджували до кімнатної температури.Отриманий зразок (відтепер іменований як AgNP-I) використовується як основа для опосередкованого насінням росту на наступному етапі синтезу.
Щоб синтезувати суспензію частинок середнього розміру (позначену як AgNP-II), нагрійте 90 мл 7,6 мМ розчину цитрату до 80°C, змішайте його з 10 мл AgNP-I, а потім змішайте 2 мл 1% розчину AgNO3. витримували при інтенсивному механічному перемішуванні протягом 1 години, а потім зразок охолоджували до кімнатної температури.
Для найбільшої частинки (AgNP-III) повторіть той самий процес росту, але в цьому випадку використовуйте 10 мл AgNP-II як суспензію насіння.Після того, як зразки досягають кімнатної температури, вони встановлюють номінальну концентрацію Ag на основі загального вмісту AgNO3 на рівні 150 частин на мільйон шляхом додавання або випаровування додаткового розчинника при 40 °C і, нарешті, зберігають їх при 4 °C до подальшого використання.
Використовуйте трансмісійний електронний мікроскоп (TEM) FEI Tecnai G2 20 X-Twin (штаб-квартира FEI, Хіллсборо, штат Орегон, США) з прискорювальною напругою 200 кВ, щоб дослідити морфологічні характеристики наночастинок і зафіксувати їх картину електронної дифракції (ED).Принаймні 15 репрезентативних зображень (~750 частинок) було оцінено за допомогою програмного пакета ImageJ, а отримані гістограми (і всі графіки в усьому дослідженні) були створені в OriginPro 2018 (OriginLab, Нортгемптон, Массачусетс, США) 33, 34.
Середній гідродинамічний діаметр (Z-середнє), дзета-потенціал (ζ-потенціал) і характерний поверхневий плазмонний резонанс (SPR) зразків були виміряні для ілюстрації їх початкових колоїдних властивостей.Середній гідродинамічний діаметр і дзета-потенціал зразка вимірювали приладом Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Малверн, Великобританія) з використанням одноразових складених капілярних комірок при 37±0,1°C.Ocean Optics 355 DH-2000-BAL UV-Vis спектрофотометр (Halma PLC, Ларго, штат Флорида, США) використовувався для отримання характерних SPR характеристик зі спектрів поглинання UV-Vis зразків у діапазоні 250-800 нм.
Протягом всього експерименту одночасно проводились три різні типи вимірювань, пов’язаних із колоїдною стабільністю.Використовуйте DLS для вимірювання середнього гідродинамічного діаметра (середнє значення Z) і дзета-потенціалу (потенціал ζ) частинок, оскільки середнє значення Z пов’язане із середнім розміром агрегатів наночастинок, а дзета-потенціал показує, чи електростатичне відштовхування в системі є достатньо сильним, щоб компенсувати тяжіння Ван-дер-Ваальса між наночастинками.Вимірювання проводяться в трьох примірниках, а стандартне відхилення середнього Z і дзета-потенціалу розраховується за допомогою програмного забезпечення Zetasizer.Характеристичні спектри SPR частинок оцінюються за допомогою УФ-видимої спектроскопії, оскільки зміни пікової інтенсивності та довжини хвилі можуть вказувати на агрегацію та поверхневу взаємодію.29,35 Насправді поверхневий плазмонний резонанс у дорогоцінних металах настільки впливовий, що призвів до нових методів аналізу біомолекул.29,36,37 Концентрація AgNPs в експериментальній суміші становить близько 10 ppm, і мета полягає в тому, щоб встановити інтенсивність максимального початкового поглинання SPR рівним 1. Експеримент проводився залежно від часу при 0;1,5;3;6;12 і 24 години в різних біологічно відповідних умовах.Детальніше з описом експерименту можна побачити в нашій попередній роботі.19 Коротше кажучи, різні значення рН (3; 5; 7,2 і 9), різні концентрації хлориду натрію (10 мМ; 50 мМ; 150 мМ), глюкози (3,9 мМ; 6,7 мМ) і глутаміну (4 мМ) і також підготували модифіковане середовище Ігла Дульбекко (DMEM) і фетальну бичачу сироватку (FBS) (у воді та DMEM) як модельні системи та вивчили їхній вплив на поведінку агрегації синтезованих наночастинок срібла.Значення рН, NaCl, глюкози та глутаміну оцінюються на основі фізіологічних концентрацій, тоді як кількості DMEM та FBS такі ж, як і рівні, що використовуються у всьому експерименті in vitro.38-42 Усі вимірювання проводили при рН 7,2 і 37°C з постійною фоновою концентрацією солі 10 мМ NaCl, щоб усунути будь-які взаємодії частинок на великій відстані (за винятком певних експериментів, пов’язаних з pH і NaCl, де ці атрибути є змінними під вивчення).28 Перелік різних умов підсумовано в таблиці 1. Експеримент, позначений †, використовується як еталонний і відповідає зразку, що містить 10 мМ NaCl і pH 7,2.
Лінія клітин раку передміхурової залози людини (DU145) і імморталізовані кератиноцити людини (HaCaT) були отримані від ATCC (Манассас, Вірджинія, США).Клітини зазвичай культивують у мінімальному незамінному середовищі Дульбекко Eagle (DMEM), що містить 4,5 г/л глюкози (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США), доповнене 10% FBS, 2 мМ L-глутаміну, 0,01% стрептоміцину та 0,005% Пеніцилін (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA).Клітини культивують в інкубаторі при 37°C при 5% CO2 і 95% вологості.
Щоб дослідити зміни в цитотоксичності AgNP, спричинені агрегацією частинок залежно від часу, було проведено двоетапний аналіз MTT.Спочатку вимірювали життєздатність двох типів клітин після обробки AgNP-I, AgNP-II та AgNP-III.З цією метою два типи клітин висівали в 96-лункові планшети з щільністю 10 000 клітин на лунку та обробляли трьома різними розмірами наночастинок срібла у зростаючих концентраціях на другий день.Після 24 годин обробки клітини промивали PBS та інкубували з 0,5 мг/мл реагенту MTT (SERVA, Гейдельберг, Німеччина), розведеного в культуральному середовищі, протягом 1 години при 37°C.Кристали формазану розчиняли в ДМСО (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США), і вимірювали поглинання при 570 нм за допомогою пристрою для зчитування пластин Synergy HTX (BioTek-Угорщина, Будапешт, Угорщина).Значення поглинання необробленого контрольного зразка вважається рівним 100% виживаності.Виконайте щонайменше 3 експерименти, використовуючи чотири незалежні біологічні повтори.IC50 розраховується з кривої дози-відповіді на основі результатів життєздатності.
Після цього, на другому етапі, інкубуючи частинки з 150 мМ NaCl протягом різних періодів часу (0, 1,5, 3, 6, 12 і 24 години) перед обробкою клітин, були отримані різні агрегатні стани наночастинок срібла.Згодом був проведений той самий аналіз МТТ, як описано раніше, для оцінки змін у життєздатності клітин, на які впливає агрегація частинок.Використовуйте GraphPad Prism 7, щоб оцінити кінцевий результат, обчислити статистичну значущість експерименту за допомогою непарного t-критерію та позначити його рівень * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01), *** (p ≤ 0,001). ) І **** (p ≤ 0,0001).
Наночастинки срібла трьох різних розмірів (AgNP-I, AgNP-II та AgNP-III) використовували для визначення антибактеріальної чутливості до Cryptococcus neoformans IFM 5844 (IFM; Дослідницький центр патогенних грибів та мікробної токсикології, Університет Чіба) та Bacillus Test megaterium SZMC 6031 (SZMC: Szeged Microbiology Collection) та E. coli SZMC 0582 у середовищі RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Co.).Щоб оцінити зміни антибактеріальної активності, спричинені агрегацією частинок, спочатку визначали їх мінімальну інгібіторну концентрацію (МІК) шляхом мікророзведення в 96-лунковому мікропланшеті.До 50 мкл стандартизованої клітинної суспензії (5 × 104 клітин/мл у середовищі RPMI 1640) додайте 50 мкл суспензії наночастинок срібла та послідовно розбавте концентрацію вдвічі (у вищезгаданому середовищі діапазон становить 0 і 75 ppm, тобто контрольний зразок містить 50 мкл клітинної суспензії та 50 мкл середовища без наночастинок).Після цього планшет інкубували при 30°C протягом 48 годин, і оптичну щільність культури вимірювали при 620 нм за допомогою пристрою для зчитування планшетів SPECTROstar Nano (BMG LabTech, Оффенбург, Німеччина).Експеримент проводили три рази в трьох повторах.
За винятком того, що в цей час використовували 50 мкл окремих агрегованих зразків наночастинок, ту ж процедуру, що описана раніше, використовували для вивчення впливу агрегації на антибактеріальну активність вищезгаданих штамів.Різні агрегатні стани наночастинок срібла отримують шляхом інкубації частинок із 150 мМ NaCl протягом різних періодів часу (0, 1,5, 3, 6, 12 та 24 години) перед обробкою клітин.Суспензію, доповнену 50 мкл середовища RPMI 1640, використовували як контроль росту, тоді як для контролю токсичності використовували суспензію з неагрегованими наночастинками.Експеримент проводили три рази в трьох повторах.Використовуйте GraphPad Prism 7, щоб знову оцінити кінцевий результат, використовуючи той самий статистичний аналіз, що й аналіз MTT.
Рівень агрегації найдрібніших частинок (AgNP-I) був охарактеризований, і результати були частково опубліковані в нашій попередній роботі, але для кращого порівняння всі частинки були ретельно перевірені.Експериментальні дані зібрані та обговорені в наступних розділах.Три розміри AgNP.19
Вимірювання, проведені за допомогою TEM, UV-Vis та DLS, підтвердили успішний синтез усіх зразків AgNP (рис. 2A-D).Згідно з першим рядком рисунка 2, найменша частинка (AgNP-I) має рівномірну сферичну морфологію із середнім діаметром приблизно 10 нм.Метод росту, опосередкованого насінням, також забезпечує AgNP-II і AgNP-III з різними діапазонами розмірів із середнім діаметром частинок приблизно 20 нм і 50 нм відповідно.За стандартним відхиленням розподілу частинок розміри трьох зразків не перекриваються, що важливо для їх порівняльного аналізу.Порівнюючи середнє співвідношення сторін і коефіцієнт тонкості двовимірних проекцій частинок на основі ТЕМ, припускається, що сферичність частинок оцінюється плагіном фільтра форми ImageJ (рис. 2E).43 Відповідно до аналізу форми частинок, їх співвідношення сторін (велика сторона/коротка сторона найменшого обмежувального прямокутника) не залежить від росту частинок, а їх співвідношення тонкості (виміряна площа відповідного ідеального кола/теоретична площа ) поступово зменшується.Це призводить до появи все більшої кількості багатогранних частинок, які теоретично ідеально круглі, що відповідає коефіцієнту тонкості 1.
Рисунок 2. Зображення за допомогою трансмісійного електронного мікроскопа (ТЕМ) (A), картина електронної дифракції (ED) (B), гістограма розподілу за розміром (C), характерний спектр поглинання світла у видимій області ультрафіолету (UV-Vis) (D) і середній рідинний цитрат Наночастинки срібла з кінцевими кінцями з механічним діаметром (Z-середнє), дзета-потенціалом, співвідношенням сторін і співвідношенням товщини (E) мають три різні діапазони розмірів: AgNP-I становить 10 нм (верхній ряд), AgNP -II становить 20 нм (середній рядок). ), AgNP-III (нижній ряд) становить 50 нм.
Хоча циклічний характер методу вирощування певною мірою вплинув на форму частинок, що призвело до меншої сферичності більших AgNP, усі три зразки залишилися квазісферичними.Крім того, як показано на картині електронної дифракції на малюнку 2B, нанокристалічність частинок не впливає.Помітне дифракційне кільце, яке можна співвіднести з індексами Міллера (111), (220), (200) і (311) срібла, дуже узгоджується з науковою літературою та нашими попередніми внесками.9, 19,44 Фрагментація кільця Дебая-Шеррера AgNP-II та AgNP-III пов’язана з тим, що ED-зображення фіксується з однаковим збільшенням, тому зі збільшенням розміру частинок кількість дифрагованих частинок на одиниця площі збільшується і зменшується.
Відомо, що розмір і форма наночастинок впливають на біологічну активність.3,45 Каталітичну та біологічну активність, залежну від форми, можна пояснити тим фактом, що різні форми прагнуть поширювати певні кристалічні грані (з різними індексами Міллера), і ці кристалічні грані мають різну активність.45,46 Оскільки підготовлені частинки забезпечують подібні результати ED, що відповідають дуже схожим характеристикам кристалів, можна припустити, що в наших подальших експериментах з колоїдною стабільністю та біологічною активністю будь-які спостережувані відмінності слід віднести до розміру наночастинок, а не до властивостей, пов’язаних з формою.
Результати UV-Vis, узагальнені на малюнку 2D, додатково підкреслюють переважну сферичну природу синтезованого AgNP, оскільки піки SPR усіх трьох зразків становлять близько 400 нм, що є характерним значенням для сферичних наночастинок срібла.29,30 Зняті спектри також підтвердили успішне зростання наносрібла за допомогою насіння.У міру збільшення розміру частинок довжина хвилі, що відповідає максимальному поглинанню світла AgNP-II, стає більш помітною. Відповідно до літератури, AgNP-III зазнало червоного зсуву.6,29
Що стосується початкової колоїдної стабільності системи AgNP, DLS використовувався для вимірювання середнього гідродинамічного діаметра та дзета-потенціалу частинок при pH 7,2.Результати, зображені на малюнку 2E, показують, що AgNP-III має вищу колоїдну стабільність, ніж AgNP-I або AgNP-II, оскільки загальні вказівки вказують на те, що дзета-потенціал 30 мВ абсолютний необхідний для довгострокової колоїдної стабільності. Цей висновок додатково підтверджується, коли середнє значення Z (отримане як середній гідродинамічний діаметр вільних і агрегованих частинок) порівнюється з первинним розміром частинок, отриманим за допомогою ТЕМ, оскільки чим ближче ці два значення, тим менший ступінь Gather у зразку.Фактично, середнє значення Z для AgNP-I та AgNP-II є достатньо вищим, ніж їхній основний розмір частинок, оцінений за допомогою ТЕМ, тому, порівняно з AgNP-III, прогнозується більша ймовірність агрегування цих зразків, де дуже негативний дзета-потенціал супроводжується близьким за розміром середнім значенням Z.
Пояснення цьому феномену може бути подвійним.З одного боку, концентрація цитрату підтримується на однаковому рівні на всіх етапах синтезу, забезпечуючи відносно велику кількість заряджених поверхневих груп, щоб запобігти зменшенню питомої площі поверхні зростаючих частинок.Однак, за словами Левака та ін., невеликі молекули, такі як цитрат, можуть легко обмінюватися біомолекулами на поверхні наночастинок.У цьому випадку колоїдна стабільність буде визначатися короною утворених біомолекул.31 Оскільки така поведінка також спостерігалася в наших вимірюваннях агрегації (обговорюваних більш детально пізніше), лише цитратне обмеження не може пояснити це явище.
З іншого боку, розмір частинок обернено пропорційний тенденції до агрегації на нанометровому рівні.Це в основному підтверджується традиційним методом Дерягіна-Ландау-Фервея-Овербіка (DLVO), де притягання частинок описується як сума сил притягання та відштовхування між частинками.Відповідно до He та ін., максимальне значення енергетичної кривої DLVO зменшується з розміром наночастинок у наночастинках гематиту, що полегшує досягнення мінімальної первинної енергії, тим самим сприяючи необоротній агрегації (конденсації).47 Однак існує припущення, що існують інші аспекти, що виходять за рамки обмежень теорії DLVO.Хоча сила тяжіння Ван-дер-Ваальса та електростатичне відштовхування подвійного шару подібні зі збільшенням розміру частинок, огляд Hotze et al.припускає, що це має сильніший вплив на агрегацію, ніж дозволяє DLVO.14 Вони вважають, що кривизна поверхні наночастинок більше не може бути оцінена як плоска поверхня, що робить математичну оцінку непридатною.Крім того, із зменшенням розміру частинок відсоток атомів, присутніх на поверхні, стає вищим, що призводить до електронної структури та поведінки поверхневого заряду.І поверхнева реактивність змінюється, що може призвести до зменшення заряду в подвійному електричному шарі та сприяти агрегації.
Порівнюючи результати DLS для AgNP-I, AgNP-II та AgNP-III на малюнку 3, ми помітили, що всі три зразки показали подібну рН-спонукальну агрегацію.Сильно кисле середовище (pH 3) зміщує дзета-потенціал зразка до 0 мВ, змушуючи частинки утворювати агрегати мікронного розміру, тоді як лужний pH зміщує дзета-потенціал до більшого від’ємного значення, де частинки утворюють менші агрегати (pH 5). ).І 7.2) ), або залишаються повністю неагрегованими (рН 9).Також спостерігалися деякі важливі відмінності між різними зразками.Під час експерименту AgNP-I виявився найбільш чутливим до змін дзета-потенціалу, спричинених pH, оскільки дзета-потенціал цих частинок був знижений при pH 7,2 порівняно з pH 9, тоді як AgNP-II та AgNP-III показали лише A значна зміна ζ становить близько pH 3. Крім того, AgNP-II продемонстрував повільніші зміни та помірний дзета-потенціал, тоді як AgNP-III продемонстрував найм’якшу поведінку з трьох, оскільки система показала найвище абсолютне дзета-значення та повільний рух тенденції, що вказує на AgNP-III Найбільш стійкий до рН-індукованої агрегації.Ці результати узгоджуються з результатами вимірювання середнього гідродинамічного діаметра.Враховуючи розмір частинок їхніх праймерів, AgNP-I продемонстрував постійну поступову агрегацію при всіх значеннях рН, швидше за все, через 10 мМ NaCl фону, тоді як AgNP-II та AgNP-III показали значне збирання лише при рН 3.Найцікавіша відмінність полягає в тому, що незважаючи на великий розмір наночастинок, AgNP-III утворює найменші агрегати при рН 3 за 24 години, підкреслюючи його антиагрегаційні властивості.Поділивши середнє значення Z AgNP при pH 3 через 24 години на значення підготовленого зразка, можна помітити, що відносні розміри агрегатів AgNP-I та AgNP-II зросли в 50 разів, 42 рази та 22 рази. , відповідно.III.
Рисунок 3 Результати динамічного розсіювання світла зразка наночастинок срібла з цитратними кінцями зі збільшенням розміру (10 нм: AgNP-I, 20 нм: AgNP-II і 50 нм: AgNP-III) виражені як середній гідродинамічний діаметр (середнє Z ) (праворуч) За різних умов pH дзета-потенціал (ліворуч) змінюється протягом 24 годин.
Спостережувана pH-залежна агрегація також вплинула на характерний поверхневий плазмонний резонанс (SPR) зразків AgNP, про що свідчать їхні УФ-видимі спектри.Згідно з додатковим малюнком S1, агрегація всіх трьох суспензій наночастинок срібла супроводжується зменшенням інтенсивності їхніх піків SPR і помірним червоним зсувом.Ступінь цих змін як функція pH узгоджується зі ступенем агрегації, передбаченим результатами DLS, однак спостерігаються деякі цікаві тенденції.Всупереч інтуїції, виявилося, що AgNP-II середнього розміру найбільш чутливий до змін SPR, тоді як інші два зразки менш чутливі.У дослідженнях SPR 50 нм є теоретичним обмеженням розміру частинок, яке використовується для розрізнення частинок на основі їхніх діелектричних властивостей.Частинки розміром менше 50 нм (AgNP-I та AgNP-II) можна описати як прості діелектричні диполі, тоді як частинки, які досягають або перевищують цю межу (AgNP-III), мають складніші діелектричні властивості, а їх резонансна смуга розпадається на мультимодальні зміни. .У випадку двох менших зразків частинок AgNPs можна розглядати як прості диполі, і плазма може легко перекриватися.У міру збільшення розміру частинок цей зв’язок створює більшу плазму, що може пояснити спостережувану вищу чутливість.29 Однак для найбільших частинок проста дипольна оцінка недійсна, коли також можуть виникнути інші стани зв’язку, що може пояснити знижену тенденцію AgNP-III вказувати на спектральні зміни.29
У наших експериментальних умовах доведено, що значення pH має глибокий вплив на колоїдну стабільність покритих цитратом наночастинок срібла різного розміру.У цих системах стабільність забезпечується негативно зарядженими групами -COO- на поверхні AgNPs.Карбоксилатна функціональна група цитрат-іона протонується у великій кількості іонів Н+, тому утворена карбоксильна група більше не може забезпечувати електростатичне відштовхування між частинками, як показано у верхньому рядку рисунка 4. Згідно з принципом Ле Шательє, AgNP зразки швидко агрегують при pH 3, але поступово стають все більш і більш стабільними в міру підвищення pH.
Рисунок 4 Схематичний механізм взаємодії поверхні, визначений агрегацією за різного рН (верхній ряд), концентрації NaCl (середній ряд) і біомолекул (нижній ряд).
Згідно з малюнком 5, колоїдна стабільність суспензій AgNP різних розмірів також перевірялася при зростанні концентрації солі.Виходячи з дзета-потенціалу, збільшений розмір наночастинок у цих системах AgNP із цитратним закінченням знову забезпечує підвищену стійкість до зовнішніх впливів NaCl.У AgNP-I 10 мМ NaCl достатньо, щоб викликати помірну агрегацію, а концентрація солі 50 мМ забезпечує дуже подібні результати.В AgNP-II і AgNP-III 10 мМ NaCl не впливає суттєво на дзета-потенціал, оскільки їх значення залишаються на рівні (AgNP-II) або нижче (AgNP-III) -30 мВ.Збільшення концентрації NaCl до 50 мМ і, нарешті, до 150 мМ NaCl достатньо, щоб значно знизити абсолютне значення дзета-потенціалу у всіх зразках, хоча більші частинки зберігають більший негативний заряд.Ці результати узгоджуються з очікуваним середнім гідродинамічним діаметром AgNPs;лінії Z середнього тренду, виміряні на 10, 50 і 150 мМ NaCl, показують різні, поступово зростаючі значення.Нарешті, агрегати мікронного розміру були виявлені у всіх трьох 150 мМ експериментах.
Рисунок 5 Результати динамічного розсіювання світла зразка наночастинок срібла з цитратними кінцями зі збільшенням розміру (10 нм: AgNP-I, 20 нм: AgNP-II і 50 нм: AgNP-III) виражені як середній гідродинамічний діаметр (середнє Z ) (праворуч) і дзета-потенціал (ліворуч) змінюються протягом 24 годин при різних концентраціях NaCl.
Результати UV-Vis на додатковому малюнку S2 показують, що SPR 50 і 150 мМ NaCl у всіх трьох зразках має миттєве та значне зниження.Це можна пояснити DLS, оскільки агрегація на основі NaCl відбувається швидше, ніж експерименти, залежні від рН, що пояснюється великою різницею між ранніми (0, 1,5 і 3 години) вимірюваннями.Крім того, збільшення концентрації солі також збільшить відносну діелектричну проникність експериментального середовища, що матиме глибокий вплив на поверхневий плазмонний резонанс.29
Вплив NaCl узагальнено в середньому рядку на малюнку 4. Загалом можна зробити висновок, що збільшення концентрації хлориду натрію має подібний ефект до підвищення кислотності, оскільки іони Na+ мають тенденцію координуватися навколо карбоксилатних груп, придушення AgNP з негативним дзета-потенціалом.Крім того, 150 мМ NaCl утворювало агрегати мікронного розміру у всіх трьох зразках, що вказує на те, що фізіологічна концентрація електроліту є шкідливою для колоїдної стабільності AgNPs із цитратним закінченням.Враховуючи критичну концентрацію конденсації (CCC) NaCl на подібних системах AgNP, ці результати можна грамотно розмістити у відповідній літературі.Huynh та ін.підрахували, що CCC NaCl для наночастинок срібла з цитратними кінцями із середнім діаметром 71 нм становив 47,6 мМ, тоді як El Badawy et al.спостерігали, що CCC 10 нм AgNP з цитратним покриттям становила 70 мМ.10,16 Крім того, значно високий CCC приблизно 300 мМ був виміряний He та ін., що призвело до того, що їхній метод синтезу відрізнявся від попередньо згаданої публікації.48 Хоча поточний внесок не спрямований на комплексний аналіз цих значень, оскільки наші експериментальні умови ускладнюють усе дослідження, біологічно значуща концентрація NaCl 50 мМ, особливо 150 мМ NaCl, здається досить високою.Індукована коагуляція, що пояснює виявлені сильні зміни.
Наступним кроком в експерименті полімеризації є використання простих, але біологічно відповідних молекул для моделювання взаємодії наночастинок і біомолекул.Ґрунтуючись на результатах DLS (рис. 6 і 7) і UV-Vis (додаткові малюнки S3 і S4), можна зробити деякі загальні висновки.У наших експериментальних умовах досліджувані молекули глюкози та глутаміну не будуть індукувати агрегацію в будь-якій системі AgNP, оскільки тенденція Z-середнього тісно пов’язана з відповідним еталонним значенням вимірювання.Хоча їх присутність не впливає на агрегацію, експериментальні результати показують, що ці молекули частково адсорбуються на поверхні AgNP.Найвидатнішим результатом, що підтверджує цю думку, є спостережувана зміна поглинання світла.Хоча AgNP-I не демонструє значущих змін довжини хвилі чи інтенсивності, його можна чіткіше спостерігати, вимірюючи більші частинки, що, швидше за все, пов’язано з більшою оптичною чутливістю, згаданою раніше.Незалежно від концентрації, глюкоза може спричинити більший червоний зсув через 1,5 години порівняно з контрольним вимірюванням, який становить приблизно 40 нм у AgNP-II та приблизно 10 нм у AgNP-III, що доводить наявність поверхневих взаємодій.Глютамін продемонстрував схожу тенденцію, але зміни були не такими очевидними.Крім того, варто також зазначити, що глутамін може зменшити абсолютний дзета-потенціал середніх і великих частинок.Однак, оскільки ці дзета-зміни, здається, не впливають на рівень агрегації, можна припустити, що навіть невеликі біомолекули, такі як глутамін, можуть забезпечувати певний ступінь просторового відштовхування між частинками.
Рисунок 6 Результати динамічного розсіювання світла зразків наночастинок срібла з цитратними кінцями зі збільшенням розміру (10 нм: AgNP-I, 20 нм: AgNP-II і 50 нм: AgNP-III) виражені як середній гідродинамічний діаметр (середнє Z) (праворуч) За зовнішніх умов різної концентрації глюкози дзета-потенціал (ліворуч) змінюється протягом 24 годин.
Рисунок 7 Результати динамічного розсіювання світла зразка наночастинок срібла з цитратними кінцями зі збільшенням розміру (10 нм: AgNP-I, 20 нм: AgNP-II і 50 нм: AgNP-III) виражені як середній гідродинамічний діаметр (середнє Z ) (праворуч) У присутності глутаміну дзета-потенціал (ліворуч) змінюється протягом 24 годин.
Коротше кажучи, невеликі біомолекули, такі як глюкоза та глутамін, не впливають на колоїдну стабільність при виміряній концентрації: хоча вони різною мірою впливають на дзета-потенціал та результати УФ-видимого діапазону, середні результати Z не є послідовними.Це вказує на те, що поверхнева адсорбція молекул пригнічує електростатичне відштовхування, але в той же час забезпечує стабільність розмірів.
Для того, щоб пов’язати попередні результати з попередніми результатами та більш вміло моделювати біологічні умови, ми вибрали деякі з найбільш часто використовуваних компонентів клітинної культури та використали їх як експериментальні умови для вивчення стабільності колоїдів AgNP.У всьому експерименті in vitro однією з найважливіших функцій DMEM як середовища є встановлення необхідних осмотичних умов, але з хімічної точки зору це складний сольовий розчин із загальною іонною силою, подібною до 150 мМ NaCl. .40 Що стосується FBS, то це складна суміш біомолекул, головним чином білків, з точки зору поверхневої адсорбції, вона має деякі подібності з експериментальними результатами глюкози та глутаміну, незважаючи на хімічний склад і різноманітність. Стать набагато складніша.19 DLS та UV-Випромінювання. Видимі результати, показані на рисунку 8 і додатковому малюнку S5, відповідно, можна пояснити шляхом вивчення хімічного складу цих матеріалів і співвіднесення їх із вимірюваннями в попередньому розділі.
Рисунок 8 Результати динамічного розсіювання світла зразка наночастинок срібла з цитратними кінцями зі збільшенням розміру (10 нм: AgNP-I, 20 нм: AgNP-II та 50 нм: AgNP-III) виражені як середній гідродинамічний діаметр (середнє Z ) (праворуч) У присутності компонентів культури клітин DMEM і FBS дзета-потенціал (ліворуч) змінюється протягом 24 годин.
Розведення AgNP різних розмірів у DMEM має подібний вплив на колоїдну стабільність, що спостерігається в присутності високих концентрацій NaCl.Дисперсія AgNP у 50 об.% DMEM показала, що великомасштабна агрегація була виявлена ​​зі збільшенням дзета-потенціалу та Z-середнього значення та різким зниженням інтенсивності SPR.Варто зазначити, що максимальний розмір агрегатів, індукований DMEM через 24 години, обернено пропорційний розміру наночастинок праймера.
Взаємодія між FBS і AgNP подібна до тієї, що спостерігається в присутності менших молекул, таких як глюкоза та глутамін, але ефект сильніший.Середнє значення Z частинок залишається незмінним, тоді як виявляється збільшення дзета-потенціалу.Пік SPR показав невеликий червоний зсув, але, можливо, більш цікаво, інтенсивність SPR не зменшилася так значно, як під час контрольного вимірювання.Ці результати можна пояснити вродженою адсорбцією макромолекул на поверхні наночастинок (нижній ряд на малюнку 4), що зараз розуміється як утворення біомолекулярної корони в організмі.49