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Les nanoparticules plus petites sont-elles toujours meilleures ?Comprendre les effets biologiques de l'agrégation dépendant de la taille des nanoparticules d'argent dans des conditions biologiquement pertinentes
Auteurs : Bélteky P, Rónavári A, Zakupszky D, Boka E, Igaz N, Szerencsés B, Pfeiffer I, Vágvölgyi C, Kiricsi M, Kónya Z
Péter Bélteky,1,* Andrea Rónavári,1,* Dalma Zakupszky1, Eszter Boka1, Nóra Igaz,2 Bettina Szerencsés3, Ilona Pfeiffer3, Csaba Vágvölgyi3, Mónika Kiricsi de chimie de l'environnement, Hongrie, Faculté hongroise des sciences et de l'informatique , Université de Szeged ;2 Département de biochimie et de biologie moléculaire, Faculté des sciences et de l'information, Université de Szeged, Hongrie ;3 Département de microbiologie, Faculté des sciences et de l'information, Université de Szeged, Hongrie ;Groupe de recherche sur la cinétique des réactions et la chimie des surfaces 4MTA-SZTE, Szeged, Hongrie* Ces auteurs ont contribué à parts égales à ce travail.Communication : Zoltán Kónya Département de chimie appliquée et environnementale, Faculté des sciences et d'informatique, Université de Szeged, Rerrich Square 1, Szeged, H-6720, Hongrie Téléphone +36 62 544620 E-mail [Protection des e-mails] Objectif : Les nanoparticules d'argent (AgNP) sont l’un des nanomatériaux les plus étudiés, notamment en raison de leurs applications biomédicales.Cependant, en raison de l’agrégation des nanoparticules, leur excellente cytotoxicité et leur activité antibactérienne sont souvent compromises dans les milieux biologiques.Dans ce travail, le comportement d’agrégation et les activités biologiques associées de trois échantillons différents de nanoparticules d’argent terminées par du citrate et d’un diamètre moyen de 10, 20 et 50 nm ont été étudiés.Méthode : Utiliser le microscope électronique à transmission pour synthétiser et caractériser les nanoparticules, évaluer leur comportement d'agrégation à diverses valeurs de pH, concentrations de NaCl, de glucose et de glutamine par diffusion dynamique de la lumière et spectroscopie ultraviolette-visible.De plus, dans le milieu de culture cellulaire, des composants tels que Dulbecco améliorent le comportement d'agrégation dans Eagle Medium et Fetal Calf Serum.Résultats : Les résultats montrent que le pH acide et la teneur en électrolytes physiologiques induisent généralement une agrégation à l’échelle micrométrique, qui peut être médiée par la formation d’une couronne biomoléculaire.Il convient de noter que les particules plus grosses présentent une plus grande résistance aux influences extérieures que leurs homologues plus petites.Des tests de cytotoxicité et antibactériens in vitro ont été réalisés en traitant des cellules avec des agrégats de nanoparticules à différents stades d'agrégation.Conclusion : Nos résultats révèlent une profonde corrélation entre la stabilité colloïdale et la toxicité des AgNP, car une agrégation extrême conduit à une perte totale de l'activité biologique.Le degré plus élevé d’antiagrégation observé pour les particules plus grosses a un impact significatif sur la toxicité in vitro, car ces échantillons conservent davantage d’activité antimicrobienne et cellulaire de mammifère.Ces résultats conduisent à la conclusion que, malgré l’opinion générale exprimée dans la littérature pertinente, cibler les nanoparticules les plus petites possibles n’est peut-être pas la meilleure solution.Mots clés : croissance médiée par les graines, stabilité colloïdale, comportement d'agrégation dépendant de la taille, toxicité des dommages d'agrégation
Alors que la demande et la production de nanomatériaux continuent d’augmenter, une attention croissante est accordée à leur biosécurité ou à leur activité biologique.Les nanoparticules d'argent (AgNP) sont l'un des représentants de cette classe de matériaux les plus couramment synthétisés, étudiés et utilisés en raison de leurs excellentes propriétés catalytiques, optiques et biologiques.1 On pense généralement que les caractéristiques uniques des nanomatériaux (y compris les AgNP) sont principalement attribuées à leur grande surface spécifique.Par conséquent, le problème inévitable est de savoir si tout processus affectant cette caractéristique clé, telle que la taille des particules, le revêtement de surface ou l'agrégation, endommagera gravement les propriétés des nanoparticules qui sont essentielles à des applications spécifiques.
Les effets de la taille des particules et des stabilisants sont des sujets relativement bien documentés dans la littérature.Par exemple, l’opinion généralement acceptée est que les nanoparticules plus petites sont plus toxiques que les nanoparticules plus grosses.2 Conformément à la littérature générale, nos études précédentes ont démontré l'activité du nanoargent dépendante de la taille sur les cellules et les micro-organismes de mammifères.3– 5 Le revêtement de surface est un autre attribut qui a une large influence sur les propriétés des nanomatériaux.En ajoutant ou en modifiant simplement des stabilisants à sa surface, le même nanomatériau peut avoir des propriétés physiques, chimiques et biologiques complètement différentes.L'application d'agents de coiffage est le plus souvent réalisée dans le cadre de la synthèse de nanoparticules.Par exemple, les nanoparticules d'argent à terminaison citrate sont l'une des AgNP les plus pertinentes dans la recherche, qui sont synthétisées en réduisant les sels d'argent dans une solution stabilisante sélectionnée comme milieu réactionnel.Le citrate 6 peut facilement tirer parti de son faible coût, de sa disponibilité, de sa biocompatibilité et de sa forte affinité pour l’argent, qui peuvent se refléter dans diverses interactions proposées, de l’adsorption de surface réversible aux interactions ioniques.Les petites molécules et les ions polyatomiques proches de 7,8, tels que les citrates, les polymères, les polyélectrolytes et les agents biologiques, sont également couramment utilisés pour stabiliser le nano-argent et y effectuer des fonctionnalisations uniques.9-12
Bien que la possibilité de modifier l’activité des nanoparticules par coiffage intentionnel de la surface soit un domaine très intéressant, le rôle principal de ce revêtement de surface est négligeable, assurant la stabilité colloïdale du système de nanoparticules.La grande surface spécifique des nanomatériaux produira une énergie de surface importante, ce qui entrave la capacité thermodynamique du système à atteindre son énergie minimale.13 Sans stabilisation adéquate, cela peut conduire à une agglomération de nanomatériaux.L'agrégation est la formation d'agrégats de particules de formes et de tailles diverses qui se produit lorsque des particules dispersées se rencontrent et que les interactions thermodynamiques actuelles permettent aux particules d'adhérer les unes aux autres.Par conséquent, des stabilisants sont utilisés pour empêcher l’agrégation en introduisant une force répulsive suffisamment importante entre les particules pour contrecarrer leur attraction thermodynamique.14
Bien que le sujet de la taille des particules et de la couverture de surface ait été étudié en profondeur dans le contexte de la régulation des activités biologiques déclenchées par les nanoparticules, l’agrégation des particules est un domaine largement négligé.Il n’existe pratiquement aucune étude approfondie pour résoudre la stabilité colloïdale des nanoparticules dans des conditions biologiquement pertinentes.10,15-17 De plus, cette contribution est particulièrement rare, là où la toxicité associée à l'agrégation a également été étudiée, même si elle peut provoquer des effets indésirables, comme une thrombose vasculaire, ou une perte de caractéristiques souhaitées, comme sa toxicité, comme illustré à la figure 1.18, 19 illustré.En fait, l’un des rares mécanismes connus de résistance aux nanoparticules d’argent est lié à l’agrégation, car certaines souches d’E. coli et de Pseudomonas aeruginosa réduiraient leur sensibilité aux nanoparticules d’argent en exprimant la protéine flagelline, la flagelline.Il possède une grande affinité pour l’argent, induisant ainsi une agrégation.20
Il existe plusieurs mécanismes différents liés à la toxicité des nanoparticules d’argent, et l’agrégation affecte tous ces mécanismes.La méthode la plus discutée de l’activité biologique des AgNP, parfois appelée mécanisme du « cheval de Troie », considère les AgNP comme des porteurs d’Ag+.1,21 Le mécanisme du cheval de Troie peut assurer une forte augmentation de la concentration locale en Ag+, ce qui conduit à la génération de ROS et à une dépolarisation membranaire.22-24 L'agrégation peut affecter la libération d'Ag+, affectant ainsi la toxicité, car elle réduit la surface active efficace où les ions argent peuvent être oxydés et dissous.Cependant, les AgNP ne présenteront pas seulement une toxicité par libération d’ions.De nombreuses interactions liées à la taille et à la morphologie doivent être prises en compte.Parmi elles, la taille et la forme de la surface des nanoparticules sont les caractéristiques déterminantes.4,25 L’ensemble de ces mécanismes peut être classé dans la catégorie des « mécanismes de toxicité induite ».Il existe potentiellement de nombreuses réactions mitochondriales et membranaires de surface qui peuvent endommager les organites et provoquer la mort cellulaire.25-27 Étant donné que la formation d'agrégats affecte naturellement la taille et la forme des objets contenant de l'argent reconnus par les systèmes vivants, ces interactions peuvent également être affectées.
Dans notre précédent article sur l’agrégation des nanoparticules d’argent, nous avons démontré une procédure de criblage efficace comprenant des expériences chimiques et biologiques in vitro pour étudier ce problème.19 La diffusion dynamique de la lumière (DLS) est la technique privilégiée pour ces types d'inspection car le matériau peut diffuser des photons à une longueur d'onde comparable à la taille de ses particules.Étant donné que la vitesse de mouvement brownienne des particules dans le milieu liquide est liée à la taille, la modification de l'intensité de la lumière diffusée peut être utilisée pour déterminer le diamètre hydrodynamique moyen (moyenne Z) de l'échantillon liquide.28 De plus, en appliquant une tension à l’échantillon, le potentiel zêta (potentiel ζ) de la nanoparticule peut être mesuré de manière similaire à la valeur moyenne Z.13,28 Si la valeur absolue du potentiel zêta est suffisamment élevée (selon les directives générales > ±30 mV), elle générera une forte répulsion électrostatique entre les particules pour contrecarrer l'agrégation.La résonance plasmonique de surface caractéristique (SPR) est un phénomène optique unique, principalement attribué aux nanoparticules de métaux précieux (principalement Au et Ag).29​​ Sur la base des oscillations électroniques (plasmons de surface) de ces matériaux à l'échelle nanométrique, on sait que les AgNP sphériques ont un pic d'absorption UV-Vis caractéristique proche de 400 nm.30 L'intensité et le décalage de longueur d'onde des particules sont utilisés pour compléter les résultats du DLS, car cette méthode peut être utilisée pour détecter l'agrégation de nanoparticules et l'adsorption de surface de biomolécules.
Sur la base des informations obtenues, les tests de viabilité cellulaire (MTT) et antibactériens sont effectués de manière à décrire la toxicité de l'AgNP en fonction du niveau d'agrégation, plutôt que de la concentration de nanoparticules (le facteur le plus couramment utilisé).Cette méthode unique nous permet de démontrer l’importance profonde du niveau d’agrégation dans l’activité biologique, car, par exemple, les AgNP terminés par du citrate perdent complètement leur activité biologique en quelques heures en raison de l’agrégation.19
Dans les travaux actuels, nous visons à élargir considérablement nos contributions précédentes sur la stabilité des colloïdes bio-liés et leur impact sur l'activité biologique en étudiant l'effet de la taille des nanoparticules sur l'agrégation des nanoparticules.C’est sans doute l’une des études sur les nanoparticules.Une perspective plus médiatisée et 31 Pour étudier ce problème, une méthode de croissance médiée par les graines a été utilisée pour produire des AgNP terminées par du citrate dans trois gammes de tailles différentes (10, 20 et 50 nm).6,32 comme l’une des méthodes les plus courantes.Pour les nanomatériaux largement et couramment utilisés dans les applications médicales, des AgNP terminés par du citrate de différentes tailles sont sélectionnés pour étudier la dépendance possible en termes de taille des propriétés biologiques du nanoargent liées à l'agrégation.Après avoir synthétisé des AgNP de différentes tailles, nous avons caractérisé les échantillons produits par microscopie électronique à transmission (TEM), puis examiné les particules à l'aide de la procédure de criblage susmentionnée.De plus, en présence de cultures cellulaires in vitro de milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) et de sérum bovin fœtal (FBS), le comportement d'agrégation dépendant de la taille et son comportement ont été évalués à diverses valeurs de pH, concentrations de NaCl, de glucose et de glutamine.Les caractéristiques de cytotoxicité sont déterminées dans des conditions globales.Le consensus scientifique indique qu’en général, les particules plus petites sont préférables ;notre enquête fournit une plateforme chimique et biologique pour déterminer si tel est le cas.
Trois nanoparticules d'argent de différentes tailles ont été préparées par la méthode de croissance par graines proposée par Wan et al., avec de légers ajustements.6 Cette méthode est basée sur la réduction chimique, utilisant le nitrate d'argent (AgNO3) comme source d'argent, le borohydrure de sodium (NaBH4) comme agent réducteur et le citrate de sodium comme stabilisant.Tout d’abord, préparez 75 ml de solution aqueuse de citrate 9 mM à partir de citrate de sodium dihydraté (Na3C6H5O7 x 2H2O) et chauffez à 70°C.Ensuite, 2 mL d'une solution d'AgNO3 à 1 % p/v ont été ajoutés au milieu réactionnel, puis la solution de borohydrure de sodium fraîchement préparée (2 mL à 0,1 % p/v) a été versée goutte à goutte dans le mélange.La suspension jaune-brun résultante a été maintenue à 70°C sous agitation vigoureuse pendant 1 heure, puis refroidie à température ambiante.L’échantillon résultant (appelé désormais AgNP-I) est utilisé comme base pour la croissance médiée par les graines lors de l’étape de synthèse suivante.
Pour synthétiser une suspension de particules de taille moyenne (notée AgNP-II), chauffez 90 ml de solution de citrate 7,6 mM à 80°C, mélangez-la avec 10 ml d'AgNP-I, puis mélangez 2 ml 1 % p/v de la solution AgNO3. a été maintenu sous agitation mécanique vigoureuse pendant 1 heure, puis l'échantillon a été refroidi à température ambiante.
Pour la plus grosse particule (AgNP-III), répétez le même processus de croissance, mais dans ce cas, utilisez 10 ml d’AgNP-II comme suspension de graines.Une fois que les échantillons ont atteint la température ambiante, ils fixent leur concentration nominale en Ag basée sur la teneur totale en AgNO3 à 150 ppm en ajoutant ou en évaporant un solvant supplémentaire à 40 °C, puis les stockent à 4 °C jusqu'à leur utilisation ultérieure.
Utilisez le microscope électronique à transmission FEI Tecnai G2 20 X-Twin (TEM) (siège social FEI, Hillsboro, Oregon, États-Unis) avec une tension d'accélération de 200 kV pour examiner les caractéristiques morphologiques des nanoparticules et capturer leur motif de diffraction électronique (ED).Au moins 15 images représentatives (~ 750 particules) ont été évaluées à l'aide du progiciel ImageJ, et les histogrammes résultants (et tous les graphiques de l'ensemble de l'étude) ont été créés dans OriginPro 2018 (OriginLab, Northampton, MA, USA) 33, 34.
Le diamètre hydrodynamique moyen (moyenne Z), le potentiel zêta (potentiel ζ) et la résonance plasmonique de surface caractéristique (SPR) des échantillons ont été mesurés pour illustrer leurs propriétés colloïdales initiales.Le diamètre hydrodynamique moyen et le potentiel zêta de l'échantillon ont été mesurés par l'instrument Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, Royaume-Uni) à l'aide de cellules capillaires repliées jetables à 37 ± 0,1 °C.Le spectrophotomètre UV-Vis Ocean Optics 355 DH-2000-BAL (Halma PLC, Largo, FL, USA) a été utilisé pour obtenir les caractéristiques SPR caractéristiques à partir des spectres d'absorption UV-Vis d'échantillons compris entre 250 et 800 nm.
Pendant toute l’expérience, trois types de mesures différents liés à la stabilité colloïdale ont été effectués simultanément.Utilisez DLS pour mesurer le diamètre hydrodynamique moyen (moyenne Z) et le potentiel zêta (potentiel ζ) des particules, car la moyenne Z est liée à la taille moyenne des agrégats de nanoparticules, et le potentiel zêta indique si la répulsion électrostatique dans le système est suffisamment fort pour compenser l’attraction de Van der Waals entre les nanoparticules.Les mesures sont effectuées en triple et l'écart type de la moyenne Z et du potentiel zêta est calculé par le logiciel Zetasizer.Les spectres SPR caractéristiques des particules sont évalués par spectroscopie UV-Vis, car les changements d'intensité maximale et de longueur d'onde peuvent indiquer une agrégation et des interactions de surface.29,35 En fait, la résonance plasmonique de surface dans les métaux précieux est si influente qu'elle a conduit à de nouvelles méthodes d'analyse des biomolécules.29,36,37 La concentration d'AgNP dans le mélange expérimental est d'environ 10 ppm et le but est de régler l'intensité de l'absorption initiale maximale du SPR à 1. L'expérience a été réalisée en fonction du temps à 0 ;1,5 ;3 ;6 ;12 et 24 heures dans diverses conditions biologiquement pertinentes.Plus de détails décrivant l’expérience peuvent être vus dans nos travaux précédents.19 En bref, différentes valeurs de pH (3 ; 5 ; 7,2 et 9), différentes concentrations de chlorure de sodium (10 mM ; 50 mM ; 150 mM), de glucose (3,9 mM ; 6,7 mM) et de glutamine (4 mM), et a également préparé le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) et le sérum bovin fœtal (FBS) (dans l'eau et le DMEM) comme systèmes modèles, et a étudié leurs effets sur le comportement d'agrégation des nanoparticules d'argent synthétisées.pH Les valeurs de NaCl, de glucose et de glutamine sont évaluées sur la base de concentrations physiologiques, tandis que les quantités de DMEM et de FBS sont les mêmes que les niveaux utilisés dans toute l'expérience in vitro.38-42 Toutes les mesures ont été effectuées à pH 7,2 et 37°C avec une concentration de sel de fond constante de 10 mM de NaCl pour éliminer toute interaction de particules à longue distance (sauf pour certaines expériences liées au pH et au NaCl, où ces attributs sont les variables sous étude).28 La liste des différentes conditions est résumée dans le tableau 1. L'expérience marquée d'un † sert de référence et correspond à un échantillon contenant 10 mM de NaCl et pH 7,2.
La lignée cellulaire du cancer de la prostate humaine (DU145) et les kératinocytes humains immortalisés (HaCaT) ont été obtenus auprès de l'ATCC (Manassas, VA, USA).Les cellules sont régulièrement cultivées dans le milieu essentiel minimum Eagle (DMEM) de Dulbecco contenant 4,5 g/L de glucose (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), complété par 10 % de FBS, 2 mM de L-glutamine, 0,01 % de streptomycine et 0,005 %. Pénicilline (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, États-Unis).Les cellules sont cultivées dans un incubateur à 37°C sous 5% de CO2 et 95% d'humidité.
Afin d'explorer les changements dans la cytotoxicité de l'AgNP provoqués par l'agrégation de particules en fonction du temps, un test MTT en deux étapes a été réalisé.Tout d’abord, la viabilité des deux types de cellules a été mesurée après traitement avec AgNP-I, AgNP-II et AgNP-III.À cette fin, les deux types de cellules ont été ensemencées dans des plaques de 96 puits à une densité de 10 000 cellules/puits et traitées avec trois tailles différentes de nanoparticules d’argent à des concentrations croissantes le deuxième jour.Après 24 heures de traitement, les cellules ont été lavées avec du PBS et incubées avec 0,5 mg/mL de réactif MTT (SERVA, Heidelberg, Allemagne) dilué dans un milieu de culture pendant 1 heure à 37°C.Les cristaux de formazan ont été dissous dans du DMSO (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) et l'absorption a été mesurée à 570 nm à l'aide d'un lecteur de plaques Synergy HTX (BioTek-Hungary, Budapest, Hongrie).La valeur d'absorption de l'échantillon témoin non traité est considérée comme un taux de survie de 100 %.Effectuez au moins 3 expériences en utilisant quatre répétitions biologiques indépendantes.La CI50 est calculée à partir d'une courbe dose-réponse basée sur les résultats de vitalité.
Par la suite, dans la deuxième étape, en incubant les particules avec 150 mM de NaCl pendant différentes périodes (0, 1,5, 3, 6, 12 et 24 heures) avant le traitement cellulaire, différents états d'agrégation des nanoparticules d'argent ont été produits.Par la suite, le même test MTT a été effectué comme décrit précédemment pour évaluer les changements dans la viabilité cellulaire affectés par l'agrégation des particules.Utilisez GraphPad Prism 7 pour évaluer le résultat final, calculez la signification statistique de l'expérience par un test t non apparié et marquez son niveau comme * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01), *** (p ≤ 0,001). ) Et **** (p ≤ 0,0001).
Trois tailles différentes de nanoparticules d'argent (AgNP-I, AgNP-II et AgNP-III) ont été utilisées pour la sensibilité antibactérienne à Cryptococcus neoformans IFM 5844 (IFM ; Centre de recherche sur les champignons pathogènes et la toxicologie microbienne, Université de Chiba) et Bacillus Test megaterium SZMC 6031. (SZMC : Szeged Microbiology Collection) et E. coli SZMC 0582 dans du milieu RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Co.).Afin d'évaluer les modifications de l'activité antibactérienne provoquées par l'agrégation de particules, leur concentration minimale inhibitrice (CMI) a été déterminée par microdilution dans une plaque de microtitration à 96 puits.À 50 μL de suspension cellulaire standardisée (5 × 104 cellules/mL dans le milieu RPMI 1640), ajoutez 50 μL de suspension de nanoparticules d'argent et diluez en série deux fois la concentration (dans le milieu susmentionné, la plage est de 0 à 75 ppm, c'est-à-dire l'échantillon témoin contient 50 μL de suspension cellulaire et 50 μL de milieu sans nanoparticules).Ensuite, la plaque a été incubée à 30 ° C pendant 48 heures et la densité optique de la culture a été mesurée à 620 nm à l'aide d'un lecteur de plaque SPECTROstar Nano (BMG LabTech, Offenburg, Allemagne).L'expérience a été réalisée trois fois en triple.
Sauf que 50 µL d’échantillons de nanoparticules agrégées uniques ont été utilisés à ce moment-là, la même procédure que celle décrite précédemment a été utilisée pour examiner l’effet de l’agrégation sur l’activité antibactérienne sur les souches susmentionnées.Différents états d'agrégation de nanoparticules d'argent sont produits en incubant les particules avec 150 mM de NaCl pendant différentes périodes (0, 1,5, 3, 6, 12 et 24 heures) avant le traitement cellulaire.Une suspension additionnée de 50 µL de milieu RPMI 1640 a été utilisée comme contrôle de croissance, tandis que afin de contrôler la toxicité, une suspension avec des nanoparticules non agrégées a été utilisée.L'expérience a été réalisée trois fois en triple.Utilisez GraphPad Prism 7 pour évaluer à nouveau le résultat final, en utilisant la même analyse statistique que l'analyse MTT.
Le niveau d'agrégation des plus petites particules (AgNP-I) a été caractérisé et les résultats ont été partiellement publiés dans nos travaux précédents, mais pour une meilleure comparaison, toutes les particules ont été minutieusement criblées.Les données expérimentales sont collectées et discutées dans les sections suivantes.Trois tailles d'AgNP.19
Les mesures effectuées par TEM, UV-Vis et DLS ont vérifié la synthèse réussie de tous les échantillons AgNP (Figure 2A-D).Selon la première rangée de la figure 2, la plus petite particule (AgNP-I) présente une morphologie sphérique uniforme avec un diamètre moyen d'environ 10 nm.La méthode de croissance médiée par les graines fournit également à AgNP-II et AgNP-III différentes plages de tailles avec des diamètres moyens de particules d'environ 20 nm et 50 nm, respectivement.Selon l'écart type de la distribution des particules, les tailles des trois échantillons ne se chevauchent pas, ce qui est important pour leur analyse comparative.En comparant le rapport d’aspect moyen et le rapport de finesse des projections 2D de particules basées sur TEM, il est supposé que la sphéricité des particules est évaluée par le plug-in de filtre de forme d’ImageJ (Figure 2E).43 D'après l'analyse de la forme des particules, leur rapport d'aspect (grand côté/petit côté du plus petit rectangle englobant) n'est pas affecté par la croissance des particules, et leur rapport de finesse (aire mesurée du cercle parfait correspondant/aire théorique ) diminue progressivement.Il en résulte de plus en plus de particules polyédriques, en théorie parfaitement rondes, correspondant à un rapport de finesse de 1.
Figure 2 Image au microscope électronique à transmission (TEM) (A), diagramme de diffraction électronique (ED) (B), histogramme de distribution de taille (C), spectre d'absorption de la lumière ultraviolette-visible (UV-Vis) caractéristique (D) et citrate fluide moyen Les nanoparticules d'argent à terminaison avec diamètre mécanique (moyenne Z), potentiel zêta, rapport d'aspect et rapport d'épaisseur (E) ont trois plages de tailles différentes : AgNP-I est de 10 nm (rangée du haut), AgNP -II est de 20 nm (rangée du milieu). ), AgNP-III (rangée du bas) est de 50 nm.
Bien que la nature cyclique de la méthode de croissance ait affecté dans une certaine mesure la forme des particules, entraînant une sphéricité plus petite des AgNP plus grands, les trois échantillons sont restés quasi-sphériques.De plus, comme le montre le diagramme de diffraction électronique de la figure 2B, la cristallinité nano des particules n'est pas affectée.L'anneau de diffraction proéminent, qui peut être corrélé aux indices de Miller (111), (220), (200) et (311) de l'argent, est très cohérent avec la littérature scientifique et nos contributions précédentes.9, 19,44 La fragmentation de l'anneau Debye-Scherrer d'AgNP-II et AgNP-III est due au fait que l'image ED est capturée au même grossissement, de sorte que plus la taille des particules augmente, le nombre de particules diffractées par la superficie unitaire augmente et diminue.
On sait que la taille et la forme des nanoparticules affectent l’activité biologique.3,45 L'activité catalytique et biologique dépendante de la forme peut s'expliquer par le fait que différentes formes ont tendance à faire proliférer certaines faces cristallines (ayant des indices de Miller différents), et que ces faces cristallines ont des activités différentes.45,46 Étant donné que les particules préparées fournissent des résultats ED similaires correspondant à des caractéristiques cristallines très similaires, on peut supposer que dans nos expériences ultérieures sur la stabilité colloïdale et l'activité biologique, toute différence observée devrait être attribuée à la taille des nanoparticules et non à leurs propriétés liées à la forme.
Les résultats UV-Vis résumés dans la figure 2D soulignent en outre la nature sphérique écrasante de l'AgNP synthétisé, car les pics SPR des trois échantillons se situent autour de 400 nm, ce qui est une valeur caractéristique des nanoparticules d'argent sphériques.29,30 Les spectres capturés ont également confirmé la croissance réussie du nanoargent par les graines.À mesure que la taille des particules augmente, la longueur d'onde correspondant à l'absorption lumineuse maximale de l'AgNP-II est plus visible. Selon la littérature, l'AgNP-III a connu un décalage vers le rouge.6,29
Concernant la stabilité colloïdale initiale du système AgNP, DLS a été utilisé pour mesurer le diamètre hydrodynamique moyen et le potentiel zêta des particules à pH 7,2.Les résultats représentés sur la figure 2E montrent que l'AgNP-III a une stabilité colloïdale supérieure à celle de l'AgNP-I ou de l'AgNP-II, car les directives courantes indiquent qu'un potentiel zêta de 30 mV absolu est nécessaire pour la stabilité colloïdale à long terme. Cette découverte est renforcée lorsque la valeur moyenne Z (obtenue comme diamètre hydrodynamique moyen des particules libres et agrégées) est comparée à la taille des particules primaires obtenue par TEM, car plus les deux valeurs sont proches, plus le degré de collecte dans l'échantillon est doux.En fait, la moyenne Z de AgNP-I et AgNP-II est raisonnablement supérieure à la taille de leurs principales particules évaluées par TEM, donc par rapport à AgNP-III, ces échantillons devraient être plus susceptibles de s'agréger, où le potentiel zêta hautement négatif est accompagné d'une taille proche de la valeur moyenne Z.
L’explication de ce phénomène peut être double.D'une part, la concentration en citrate est maintenue à un niveau similaire dans toutes les étapes de synthèse, fournissant une quantité relativement élevée de groupes de surface chargés pour empêcher la diminution de la surface spécifique des particules en croissance.Cependant, selon Levak et al., les petites molécules comme le citrate peuvent être facilement échangées par les biomolécules présentes à la surface des nanoparticules.Dans ce cas, la stabilité colloïdale sera déterminée par la couronne des biomolécules produites.31 Étant donné que ce comportement a également été observé dans nos mesures d'agrégation (discutées plus en détail plus tard), le plafonnement du citrate ne peut à lui seul expliquer ce phénomène.
En revanche, la taille des particules est inversement proportionnelle à la tendance à l’agrégation au niveau nanométrique.Ceci est principalement soutenu par la méthode traditionnelle de Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO), où l’attraction des particules est décrite comme la somme des forces attractives et répulsives entre les particules.Selon He et al., la valeur maximale de la courbe d'énergie DLVO diminue avec la taille des nanoparticules dans les nanoparticules d'hématite, ce qui facilite l'atteinte de l'énergie primaire minimale, favorisant ainsi une agrégation irréversible (condensation).47 Cependant, on suppose qu’il existe d’autres aspects au-delà des limites de la théorie DLVO.Bien que la gravité de Van der Waals et la répulsion électrostatique à double couche soient similaires avec l'augmentation de la taille des particules, une revue de Hotze et al.propose qu'il ait un effet plus fort sur l'agrégation que ne le permet le DLVO.14 Ils pensent que la courbure de la surface des nanoparticules ne peut plus être estimée comme une surface plane, ce qui rend l'estimation mathématique inapplicable.De plus, à mesure que la taille des particules diminue, le pourcentage d’atomes présents à la surface augmente, conduisant à une structure électronique et à un comportement de charge de surface.Et la réactivité de surface change, ce qui peut entraîner une diminution de la charge dans la double couche électrique et favoriser l'agrégation.
En comparant les résultats DLS de AgNP-I, AgNP-II et AgNP-III sur la figure 3, nous avons observé que les trois échantillons présentaient un pH similaire provoquant une agrégation.Un environnement fortement acide (pH 3) déplace le potentiel zêta de l'échantillon à 0 mV, provoquant la formation de particules de taille micrométrique, tandis qu'un pH alcalin déplace son potentiel zêta vers une valeur négative plus grande, où les particules forment des agrégats plus petits (pH 5). ).Et 7.2) ), ou restent complètement non agrégés (pH 9).Certaines différences importantes entre les différents échantillons ont également été observées.Tout au long de l'expérience, AgNP-I s'est avéré le plus sensible aux changements de potentiel zêta induits par le pH, car le potentiel zêta de ces particules a été réduit à pH 7,2 par rapport à pH 9, tandis que AgNP-II et AgNP-III n'ont montré qu'un A. un changement considérable de ζ se situe autour du pH 3. De plus, AgNP-II a montré des changements plus lents et un potentiel zêta modéré, tandis que AgNP-III a montré le comportement le plus doux des trois, car le système a montré la valeur zêta absolue la plus élevée et un mouvement de tendance lent, indiquant AgNP-III Le plus résistant à l’agrégation induite par le pH.Ces résultats sont cohérents avec les résultats de mesure du diamètre hydrodynamique moyen.Compte tenu de la taille des particules de leurs amorces, AgNP-I a montré une agrégation progressive constante à toutes les valeurs de pH, probablement en raison du fond de NaCl 10 mM, tandis que AgNP-II et AgNP-III n'ont montré une agrégation significative qu'à pH 3.La différence la plus intéressante est que malgré sa grande taille de nanoparticules, AgNP-III forme les plus petits agrégats à pH 3 en 24 heures, mettant en évidence ses propriétés anti-agrégation.En divisant la moyenne Z des AgNP à pH 3 après 24 heures par la valeur de l'échantillon préparé, on peut observer que les tailles relatives des agrégats d'AgNP-I et d'AgNP-II ont augmenté de 50 fois, 42 fois et 22 fois. , respectivement.III.
Figure 3 Les résultats de diffusion dynamique de la lumière de l'échantillon de nanoparticules d'argent terminées par du citrate avec une taille croissante (10 nm : AgNP-I, 20 nm : AgNP-II et 50 nm : AgNP-III) sont exprimés en diamètre hydrodynamique moyen (Z moyen ) (à droite) Dans différentes conditions de pH, le potentiel zêta (à gauche) change en 24 heures.
L'agrégation observée dépendante du pH a également affecté la résonance plasmonique de surface (SPR) caractéristique des échantillons AgNP, comme en témoignent leurs spectres UV-Vis.Selon la Figure supplémentaire S1, l'agrégation des trois suspensions de nanoparticules d'argent est suivie d'une réduction de l'intensité de leurs pics SPR et d'un décalage vers le rouge modéré.L'ampleur de ces changements en fonction du pH est cohérente avec le degré d'agrégation prédit par les résultats du DLS. Toutefois, certaines tendances intéressantes ont été observées.Contrairement à l’intuition, il s’avère que l’AgNP-II de taille moyenne est le plus sensible aux changements de SPR, tandis que les deux autres échantillons sont moins sensibles.Dans la recherche SPR, 50 nm est la limite théorique de taille des particules, utilisée pour distinguer les particules en fonction de leurs propriétés diélectriques.Les particules inférieures à 50 nm (AgNP-I et AgNP-II) peuvent être décrites comme de simples dipôles diélectriques, tandis que les particules qui atteignent ou dépassent cette limite (AgNP-III) ont des propriétés diélectriques plus complexes et leur résonance. La bande se divise en changements multimodaux .Dans le cas de deux échantillons de particules plus petits, les AgNP peuvent être considérés comme de simples dipôles et le plasma peut facilement se chevaucher.À mesure que la taille des particules augmente, ce couplage produit essentiellement un plasma plus grand, ce qui peut expliquer la sensibilité plus élevée observée.29 Cependant, pour les plus grosses particules, la simple estimation dipolaire n'est pas valide lorsque d'autres états de couplage peuvent également se produire, ce qui peut expliquer la diminution de la tendance de l'AgNP-III à indiquer des changements spectraux.29
Dans nos conditions expérimentales, il est prouvé que la valeur du pH a un effet profond sur la stabilité colloïdale des nanoparticules d’argent enrobées de citrate de différentes tailles.Dans ces systèmes, la stabilité est assurée par les groupes -COO- chargés négativement à la surface des AgNP.Le groupe fonctionnel carboxylate de l'ion citrate est protoné dans un grand nombre d'ions H+, de sorte que le groupe carboxyle généré ne peut plus fournir de répulsion électrostatique entre les particules, comme le montre la rangée supérieure de la figure 4. Selon le principe de Le Chatelier, AgNP les échantillons s'agrègent rapidement à pH 3, mais deviennent progressivement de plus en plus stables à mesure que le pH augmente.
Figure 4 Mécanisme schématique de l'interaction de surface défini par l'agrégation sous différents pH (rangée du haut), concentration de NaCl (rangée du milieu) et biomolécules (rangée du bas).
Selon la figure 5, la stabilité colloïdale dans des suspensions d'AgNP de différentes tailles a également été examinée sous des concentrations croissantes de sel.Sur la base du potentiel zêta, la taille accrue des nanoparticules dans ces systèmes AgNP terminés par du citrate offre à nouveau une résistance accrue aux influences externes du NaCl.Dans AgNP-I, 10 mM de NaCl suffisent pour induire une légère agrégation, et une concentration en sel de 50 mM donne des résultats très similaires.Dans AgNP-II et AgNP-III, 10 mM de NaCl n'affectent pas de manière significative le potentiel zêta car leurs valeurs restent à (AgNP-II) ou inférieures (AgNP-III) -30 mV.Augmenter la concentration de NaCl à 50 mM et enfin à 150 mM de NaCl suffit à réduire considérablement la valeur absolue du potentiel zêta dans tous les échantillons, bien que les particules plus grosses retiennent davantage de charge négative.Ces résultats sont cohérents avec le diamètre hydrodynamique moyen attendu des AgNP ;les lignes de tendance moyennes Z mesurées sur NaCl 10, 50 et 150 mM montrent des valeurs différentes, augmentant progressivement.Enfin, des agrégats de taille micronique ont été détectés dans les trois expériences à 150 mM.
Figure 5 Les résultats de diffusion dynamique de la lumière de l'échantillon de nanoparticules d'argent terminées par du citrate avec une taille croissante (10 nm : AgNP-I, 20 nm : AgNP-II et 50 nm : AgNP-III) sont exprimés en diamètre hydrodynamique moyen (Z moyen ) (à droite) et le potentiel zêta (à gauche) changent dans les 24 heures sous différentes concentrations de NaCl.
Les résultats UV-Vis de la Figure supplémentaire S2 montrent que le SPR de NaCl 50 et 150 mM dans les trois échantillons présente une diminution instantanée et significative.Cela peut s'expliquer par le DLS, car l'agrégation à base de NaCl se produit plus rapidement que les expériences dépendantes du pH, ce qui s'explique par la grande différence entre les mesures précoces (0, 1,5 et 3 heures).De plus, l’augmentation de la concentration en sel augmentera également la permittivité relative du milieu expérimental, ce qui aura un effet profond sur la résonance plasmonique de surface.29
L'effet du NaCl est résumé dans la rangée du milieu de la figure 4. En général, on peut conclure que l'augmentation de la concentration de chlorure de sodium a un effet similaire à l'augmentation de l'acidité, car les ions Na+ ont tendance à se coordonner autour des groupes carboxylates, supprimant les AgNP à potentiel zêta négatif.De plus, 150 mM de NaCl ont produit des agrégats de la taille d'un micron dans les trois échantillons, ce qui indique que la concentration physiologique en électrolyte est préjudiciable à la stabilité colloïdale des AgNP terminés par le citrate.En considérant la concentration critique de condensation (CCC) de NaCl sur des systèmes AgNP similaires, ces résultats peuvent être intelligemment placés dans la littérature pertinente.Huynh et coll.ont calculé que le CCC du NaCl pour les nanoparticules d'argent à terminaison citrate d'un diamètre moyen de 71 nm était de 47,6 mM, tandis qu'El Badawy et al.observé que le CCC des AgNP à 10 nm recouverts de citrate était de 70 mM.10,16 De plus, le CCC significativement élevé d'environ 300 mM a été mesuré par He et al., ce qui a rendu leur méthode de synthèse différente de la publication mentionnée précédemment.48 Bien que la contribution actuelle ne vise pas une analyse complète de ces valeurs, parce que nos conditions expérimentales augmentent dans la complexité de l'ensemble de l'étude, la concentration biologiquement pertinente de NaCl de 50 mM, en particulier de 150 mM de NaCl, semble être assez élevée.Coagulation induite, expliquant les forts changements détectés.
La prochaine étape de l’expérience de polymérisation consiste à utiliser des molécules simples mais biologiquement pertinentes pour simuler les interactions nanoparticules-biomolécules.Sur la base des résultats DLS (Figures 6 et 7) et UV-Vis (Figures supplémentaires S3 et S4), certaines conclusions générales peuvent être tirées.Dans nos conditions expérimentales, les molécules étudiées, le glucose et la glutamine, n'induiront aucune agrégation dans aucun système AgNP, car la tendance de la moyenne Z est étroitement liée à la valeur de mesure de référence correspondante.Bien que leur présence n’affecte pas l’agrégation, les résultats expérimentaux montrent que ces molécules sont partiellement adsorbées à la surface des AgNPs.Le résultat le plus important à l’appui de ce point de vue est le changement observé dans l’absorption de la lumière.Bien que l’AgNP-I ne présente pas de changements significatifs de longueur d’onde ou d’intensité, il peut être observé plus clairement en mesurant des particules plus grosses, ce qui est probablement dû à la plus grande sensibilité optique mentionnée précédemment.Quelle que soit la concentration, le glucose peut provoquer un décalage vers le rouge plus important après 1,5 heures par rapport à la mesure témoin, qui est d'environ 40 nm dans AgNP-II et d'environ 10 nm dans AgNP-III, ce qui prouve l'apparition d'interactions de surface.La glutamine a montré une tendance similaire, mais le changement n’était pas si évident.En outre, il convient également de mentionner que la glutamine peut réduire le potentiel zêta absolu des particules moyennes et grosses.Cependant, étant donné que ces changements zêta ne semblent pas affecter le niveau d’agrégation, on peut supposer que même de petites biomolécules comme la glutamine peuvent fournir un certain degré de répulsion spatiale entre les particules.
Figure 6 Les résultats de diffusion dynamique de la lumière d'échantillons de nanoparticules d'argent terminées par du citrate de taille croissante (10 nm : AgNP-I, 20 nm : AgNP-II et 50 nm : AgNP-III) sont exprimés en diamètre hydrodynamique moyen (Z moyen) (à droite) Dans des conditions externes de différentes concentrations de glucose, le potentiel zêta (à gauche) change dans les 24 heures.
Figure 7 Les résultats de diffusion dynamique de la lumière de l'échantillon de nanoparticules d'argent terminées par du citrate avec une taille croissante (10 nm : AgNP-I, 20 nm : AgNP-II et 50 nm : AgNP-III) sont exprimés en diamètre hydrodynamique moyen (Z moyen ) (à droite) En présence de glutamine, le potentiel zêta (à gauche) change en 24 heures.
En bref, les petites biomolécules comme le glucose et la glutamine n’affectent pas la stabilité colloïdale à la concentration mesurée : bien qu’elles affectent le potentiel zêta et les résultats UV-Vis à des degrés divers, les résultats moyens Z ne sont pas cohérents.Cela indique que l’adsorption superficielle des molécules inhibe la répulsion électrostatique, mais assure en même temps la stabilité dimensionnelle.
Afin de relier les résultats précédents aux résultats précédents et de simuler plus habilement les conditions biologiques, nous avons sélectionné certains des composants de culture cellulaire les plus couramment utilisés et les avons utilisés comme conditions expérimentales pour étudier la stabilité des colloïdes AgNP.Dans toute l'expérience in vitro, l'une des fonctions les plus importantes du DMEM en tant que milieu est d'établir les conditions osmotiques nécessaires, mais d'un point de vue chimique, il s'agit d'une solution saline complexe avec une force ionique totale similaire à 150 mM de NaCl. .40 Quant au FBS, il s'agit d'un mélange complexe de biomolécules - principalement de protéines - du point de vue de l'adsorption superficielle, il présente certaines similitudes avec les résultats expérimentaux du glucose et de la glutamine, malgré la composition chimique et la diversité du sexe. Le sexe est beaucoup plus compliqué.19 DLS et UV-Les résultats visibles présentés respectivement sur la figure 8 et la figure supplémentaire S5 peuvent être expliqués en examinant la composition chimique de ces matériaux et en les corrélant avec les mesures de la section précédente.
Figure 8 Les résultats de diffusion dynamique de la lumière de l'échantillon de nanoparticules d'argent terminées par du citrate avec une taille croissante (10 nm : AgNP-I, 20 nm : AgNP-II et 50 nm : AgNP-III) sont exprimés en diamètre hydrodynamique moyen (Z moyen ) (à droite) En présence de composants de culture cellulaire DMEM et FBS, le potentiel zêta (à gauche) change dans les 24 heures.
La dilution d'AgNPs de différentes tailles dans du DMEM a un effet similaire sur la stabilité colloïdale à celui observé en présence de concentrations élevées de NaCl.La dispersion de l'AgNP dans 50 v/v% de DMEM a montré qu'une agrégation à grande échelle a été détectée avec l'augmentation du potentiel zêta et de la valeur moyenne Z et la forte diminution de l'intensité du SPR.Il convient de noter que la taille maximale des agrégats induite par le DMEM après 24 heures est inversement proportionnelle à la taille des nanoparticules d'amorce.
L'interaction entre FBS et AgNP est similaire à celle observée en présence de molécules plus petites telles que le glucose et la glutamine, mais l'effet est plus fort.La moyenne Z des particules reste inchangée, tandis qu'une augmentation du potentiel zêta est détectée.Le pic SPR a montré un léger décalage vers le rouge, mais peut-être plus intéressant encore, l’intensité SPR n’a pas diminué de manière aussi significative que dans la mesure de contrôle.Ces résultats peuvent s’expliquer par l’adsorption innée de macromolécules à la surface des nanoparticules (rangée du bas de la figure 4), désormais comprise comme la formation d’une couronne biomoléculaire dans l’organisme.49