Nanoparticulele de argint (AgNP) sunt considerate a fi un instrument potențial util pentru controlul diferiților agenți patogeni.Cu toate acestea, există îngrijorări cu privire la eliberarea AgNP-urilor în mediile de mediu, deoarece acestea pot genera efecte negative asupra sănătății umane și ecologice.În acest studiu, am dezvoltat și evaluat un nou coloid hibrid magnetic (MHC) de dimensiunea unui micrometru, decorat cu AgNP-uri de diferite dimensiuni (AgNP-MHC).După ce au fost aplicate pentru dezinfecție, aceste particule pot fi ușor recuperate din mediul de mediu folosind proprietățile lor magnetice și rămân eficiente pentru inactivarea agenților patogeni virali.Am evaluat eficacitatea AgNP-MHC-urilor pentru inactivarea bacteriofagului ϕX174, norovirus murin (MNV) și adenovirus serotip 2 (AdV2).Acești virusuri țintă au fost expuși la AgNP-MHC timp de 1, 3 și 6 ore la 25°C și apoi au fost analizați prin testul plăcii și PCR TaqMan în timp real.AgNP-MHC-urile au fost expuse la o gamă largă de niveluri de pH și la apă de la robinet și de suprafață pentru a evalua efectele lor antivirale în diferite condiții de mediu.Dintre cele trei tipuri de AgNP-MHC testate, Ag30-MHC-urile au prezentat cea mai mare eficacitate pentru inactivarea virusurilor.ϕX174 și MNV au fost reduse cu mai mult de 2 log10 după expunerea la 4,6 × 109 Ag30-MHCs/ml timp de 1 oră.Aceste rezultate au indicat că AgNP-MHC-urile ar putea fi utilizate pentru a inactiva agenții patogeni virali cu șanse minime de eliberare potențială în mediu.

Odată cu progresele recente în nanotehnologie, nanoparticulele au primit o atenție sporită la nivel mondial în domeniile biotehnologiei, medicinei și sănătății publice (1,2).Datorită raportului lor mare suprafață-volum, materialele de dimensiuni nanometrice, de obicei cuprinse între 10 și 500 nm, au proprietăți fizico-chimice unice în comparație cu cele ale materialelor mai mari (1).Forma și dimensiunea nanomaterialelor pot fi controlate, iar grupurile funcționale specifice pot fi conjugate pe suprafețele lor pentru a permite interacțiunile cu anumite proteine ​​sau absorbția intracelulară (3,–5).

Nanoparticulele de argint (AgNP) au fost studiate pe scară largă ca agent antimicrobian (6).Argintul este folosit la crearea tacâmurilor fine, pentru ornamente și în agenții terapeutici.Compușii de argint, cum ar fi sulfadiazina de argint și anumite săruri, au fost utilizați ca produse de îngrijire a rănilor și ca tratamente pentru boli infecțioase datorită proprietăților lor antimicrobiene (6,7).Studii recente au arătat că AgNP-urile sunt foarte eficiente pentru inactivarea diferitelor tipuri de bacterii și viruși (8,–11).AgNP-urile și ionii Ag+ eliberați din AgNP-urile interacționează direct cu biomoleculele care conțin fosfor sau sulf, inclusiv ADN-ul, ARN-ul și proteinele (12,–14).De asemenea, s-a demonstrat că generează specii reactive de oxigen (ROS), provocând leziuni ale membranei microorganismelor (15).Mărimea, forma și concentrația AgNP-urilor sunt, de asemenea, factori importanți care le afectează capacitățile antimicrobiene (8,10,13,16,17).

Studiile anterioare au evidențiat, de asemenea, câteva probleme atunci când AgNP-urile sunt utilizate pentru controlul agenților patogeni într-un mediu de apă.În primul rând, studiile existente privind eficacitatea AgNP-urilor pentru inactivarea agenților patogeni virali în apă sunt limitate.În plus, AgNP-urile monodispersate sunt de obicei supuse agregării particule-particule din cauza dimensiunilor lor mici și a suprafeței mari, iar aceste agregate reduc eficacitatea AgNP-urilor împotriva agenților patogeni microbieni (7).În cele din urmă, s-a demonstrat că AgNP-urile au diferite efecte citotoxice (5,18,–20), iar eliberarea AgNP-urilor într-un mediu acvatic ar putea duce la sănătatea umană și probleme ecologice.

Recent, am dezvoltat un nou coloid hibrid magnetic (MHC) de dimensiunea unui micrometru decorat cu AgNP-uri de diferite dimensiuni (21,22).Miezul MHC poate fi folosit pentru a recupera compozitele AgNP din mediu.Am evaluat eficacitatea antivirală a acestor nanoparticule de argint asupra MHC-urilor (AgNP-MHCs) folosind bacteriofag ϕX174, norovirus murin (MNV) și adenovirus în diferite condiții de mediu.

Efectele antivirale ale AgNP-MHC la diferite concentrații împotriva bacteriofagului ϕX174 (a), MNV (b) și AdV2 (c).Virușii țintă au fost tratați cu diferite concentrații de AgNP-MHC și cu OH-MHC (4,6 × 109 particule/ml) ca martor, într-un incubator cu agitare (150 rpm, 1 oră, 25°C).Metoda de testare a plăcii a fost utilizată pentru a măsura virușii supraviețuitori.Valorile sunt medii ± abateri standard (SD) de la trei experimente independente.Asteriscurile indică valori semnificativ diferite (P< 0,05 prin ANOVA unidirecțional cu testul lui Dunnett).

Acest studiu a demonstrat că AgNP-MHC-urile sunt eficiente pentru inactivarea bacteriofagelor și a MNV, un surogat pentru norovirusul uman, în apă.În plus, AgNP-MHC-urile pot fi recuperate cu ușurință cu ajutorul unui magnet, prevenind eficient eliberarea AgNP-urilor potențial toxice în mediu.O serie de studii anterioare au arătat că concentrația și dimensiunea particulelor AgNP sunt factori critici pentru inactivarea microorganismului vizat (8,16,17).Efectele antimicrobiene ale AgNP depind și de tipul de microorganism.Eficacitatea AgNP-MHC pentru inactivarea ϕX174 a urmat o relație doză-răspuns.Printre AgNP-MHC-urile testate, Ag30-MHC-urile au avut o eficacitate mai mare pentru inactivarea ϕX174 și MNV.Pentru MNV, numai Ag30-MHC-uri au afișat activitate antivirală, celelalte AgNP-MHC-uri negenerând nicio inactivare semnificativă a MNV.Niciunul dintre AgNP-MHC nu a avut activitate antivirală semnificativă împotriva AdV2.

Pe lângă dimensiunea particulelor, concentrația de argint în AgNP-MHC a fost de asemenea importantă.Concentrația de argint pare să determine eficacitatea efectelor antivirale ale AgNP-MHC.Concentrațiile de argint în soluții de Ag07-MHC și Ag30-MHC la 4,6 × 109 particule/ml au fost de 28,75 ppm, respectiv 200 ppm și au fost corelate cu nivelul activității antivirale.masa 2rezumă concentrațiile de argint și suprafețele AgNP-MHC testate.Ag07-MHC-urile au afișat cea mai scăzută activitate antivirală și au avut cea mai mică concentrație de argint și cea mai mică suprafață, ceea ce sugerează că aceste proprietăți sunt legate de activitatea antivirală a AgNP-MHC.

Studiul nostru anterior a indicat că mecanismele antimicrobiene majore ale AgNP-MHC sunt extracția chimică a ionilor de Mg2+ sau Ca2+ din membranele microbiene, crearea de complexe cu grupări tiol situate la nivelul membranelor și generarea de specii reactive de oxigen (ROS) (21).Deoarece AgNP-MHC-urile au o dimensiune relativ mare a particulei (~500 nm), este puțin probabil ca acestea să poată pătrunde într-o capsidă virală.În schimb, AgNP-MHC par să interacționeze cu proteinele de suprafață virale.AgNP-urile de pe compozite tind să lege biomoleculele care conțin grupări tiol încorporate în proteinele de înveliș ale virusurilor.Prin urmare, proprietățile biochimice ale proteinelor capside virale sunt importante pentru determinarea susceptibilității lor la AgNP-MHC.figura 1arată diferitele sensibilități ale virusurilor la efectele AgNP-MHC.Bacterofagii ϕX174 și MNV au fost sensibili la AgNP-MHC, dar AdV2 a fost rezistent.Nivelul ridicat de rezistență al AdV2 este probabil asociat cu dimensiunea și structura sa.Adenovirusurile variază în dimensiune de la 70 la 100 nm (30), făcându-le mult mai mari decât ϕX174 (27 până la 33 nm) și MNV (28 până la 35 nm) (31,32).Pe lângă dimensiunile lor mari, adenovirusurile au ADN dublu catenar, spre deosebire de alți viruși, și sunt rezistenți la diferite stresuri ale mediului, cum ar fi căldura și radiațiile UV (33,34).Studiul nostru anterior a raportat că a avut loc o reducere de aproape 3-log10 a MS2 cu Ag30-MHC în decurs de 6 ore (21).MS2 și ϕX174 au dimensiuni similare cu diferite tipuri de acid nucleic (ARN sau ADN), dar au rate similare de inactivare de către Ag30-MHC.Prin urmare, natura acidului nucleic nu pare a fi factorul major pentru rezistența la AgNP-MHC.În schimb, dimensiunea și forma particulelor virale păreau a fi mai importante, deoarece adenovirusul este un virus mult mai mare.Ag30-MHC-urile au obținut o reducere de aproape 2-log10 a M13 în decurs de 6 ore (datele noastre nepublicate).M13 este un virus ADN monocatenar (35) și are ∼880 nm lungime și 6,6 nm diametru (36).Rata de inactivare a bacteriofagului filamentos M13 a fost intermediară între cele ale virusurilor mici, cu structură rotundă (MNV, ϕX174 și MS2) și ale unui virus mare (AdV2).

În studiul de față, cinetica de inactivare a MNV a fost semnificativ diferită în analiza plăcii și a testului RT-PCR (Fig. 2bșișic).c).Se știe că testele moleculare, cum ar fi RT-PCR, subestimează în mod semnificativ ratele de inactivare a virusurilor (25,28), așa cum sa constatat în studiul nostru.Deoarece AgNP-MHC interacționează în primul rând cu suprafața virală, este mai probabil să deterioreze proteinele învelișului viral, mai degrabă decât acizii nucleici virali.Prin urmare, un test RT-PCR pentru măsurarea acidului nucleic viral poate subestima semnificativ inactivarea virusurilor.Efectul ionilor Ag+ și generarea de specii reactive de oxigen (ROS) ar trebui să fie responsabile pentru inactivarea virusurilor testate.Cu toate acestea, multe aspecte ale mecanismelor antivirale ale AgNP-MHC sunt încă neclare și sunt necesare cercetări suplimentare folosind abordări biotehnologice pentru a elucida mecanismul rezistenței ridicate a AdV2.

În cele din urmă, am evaluat robustețea activității antivirale a Ag30-MHC-urilor prin expunerea acestora la o gamă largă de valori ale pH-ului și la probe de apă de la robinet și de suprafață înainte de măsurarea activității lor antivirale (Fig. 3șiși4).4).Expunerea la condiții de pH extrem de scăzut a dus la pierderea fizică și/sau funcțională a AgNP-urilor din MHC (date nepublicate).În prezența particulelor nespecifice, Ag30-MHC-urile au afișat în mod constant activitate antivirală, în ciuda unei scăderi a activității antivirale împotriva MS2.Activitatea antivirală a fost cea mai scăzută în apa de suprafață nefiltrată, deoarece o interacțiune între Ag30-MHC și particulele nespecifice din apa de suprafață foarte tulbure a determinat probabil o reducere a activității antivirale (Tabelul 3).Prin urmare, evaluările pe teren ale AgNP-MHC în diferite tipuri de apă (de exemplu, cu concentrații diferite de sare sau acid humic) ar trebui efectuate în viitor.

În concluzie, noile compozite Ag, AgNP-MHCs, au capacități antivirale excelente împotriva mai multor viruși, inclusiv ϕX174 și MNV.AgNP-MHC-urile mențin o eficacitate puternică în diferite condiții de mediu, iar aceste particule pot fi ușor recuperate folosind un magnet, reducând astfel potențialele lor efecte dăunătoare asupra sănătății umane și asupra mediului.Acest studiu a arătat că compozitul AgNP poate fi un antiviral eficient în diferite medii de mediu, fără riscuri ecologice semnificative.