Τα νανοσωματίδια αργύρου (AgNPs) θεωρούνται δυνητικά χρήσιμο εργαλείο για τον έλεγχο διαφόρων παθογόνων παραγόντων.Ωστόσο, υπάρχουν ανησυχίες σχετικά με την απελευθέρωση AgNPs σε περιβαλλοντικά μέσα, καθώς μπορεί να προκαλέσουν δυσμενείς επιπτώσεις στην ανθρώπινη υγεία και οικολογικές επιπτώσεις.Σε αυτή τη μελέτη, αναπτύξαμε και αξιολογήσαμε ένα νέο μαγνητικό υβριδικό κολλοειδές μεγέθους μικρομέτρου (MHC) διακοσμημένο με AgNPs διαφόρων μεγεθών (AgNP-MHCs).Αφού εφαρμοστούν για απολύμανση, αυτά τα σωματίδια μπορούν εύκολα να ανακτηθούν από τα περιβαλλοντικά μέσα χρησιμοποιώντας τις μαγνητικές τους ιδιότητες και να παραμείνουν αποτελεσματικά για την απενεργοποίηση των ιικών παθογόνων.Αξιολογήσαμε την αποτελεσματικότητα των AgNP-MHCs για την απενεργοποίηση του βακτηριοφάγου φΧ174, του νοροϊού ποντικού (MNV) και του ορότυπου 2 αδενοϊού (AdV2).Αυτοί οι ιοί στόχοι εκτέθηκαν σε AgNP-MHCs για 1, 3 και 6 ώρες στους 25°C και στη συνέχεια αναλύθηκαν με ανάλυση πλάκας και TaqMan PCR σε πραγματικό χρόνο.Τα AgNP-MHCs εκτέθηκαν σε ένα ευρύ φάσμα επιπέδων pH και σε νερό της βρύσης και στην επιφάνεια για να αξιολογηθούν τα αντιιικά τους αποτελέσματα κάτω από διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες.Μεταξύ των τριών τύπων AgNP-MHC που δοκιμάστηκαν, τα Ag30-MHCs παρουσίασαν την υψηλότερη αποτελεσματικότητα για την απενεργοποίηση των ιών.Το φΧ174 και το MNV μειώθηκαν κατά περισσότερο από 2 log10 μετά από έκθεση σε 4,6 × 109 Ag30-MHCs/ml για 1 ώρα.Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα AgNP-MHCs θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την αδρανοποίηση ιικών παθογόνων με ελάχιστη πιθανότητα πιθανής απελευθέρωσης στο περιβάλλον.

Με τις πρόσφατες εξελίξεις στη νανοτεχνολογία, τα νανοσωματίδια έχουν λάβει αυξημένη προσοχή παγκοσμίως στους τομείς της βιοτεχνολογίας, της ιατρικής και της δημόσιας υγείας (1,2).Λόγω της υψηλής αναλογίας επιφάνειας προς όγκο, τα υλικά νανο-μεγέθους, που συνήθως κυμαίνονται από 10 έως 500 nm, έχουν μοναδικές φυσικοχημικές ιδιότητες σε σύγκριση με εκείνες μεγαλύτερων υλικών (1).Το σχήμα και το μέγεθος των νανοϋλικών μπορούν να ελεγχθούν και συγκεκριμένες λειτουργικές ομάδες μπορούν να συζευχθούν στις επιφάνειές τους για να επιτρέψουν τις αλληλεπιδράσεις με ορισμένες πρωτεΐνες ή την ενδοκυτταρική πρόσληψη.3,–5).

Τα νανοσωματίδια αργύρου (AgNPs) έχουν μελετηθεί ευρέως ως αντιμικροβιακός παράγοντας (6).Το ασήμι χρησιμοποιείται στη δημιουργία εκλεκτών μαχαιροπήρουνων, για διακόσμηση και σε θεραπευτικούς παράγοντες.Οι ενώσεις αργύρου όπως η σουλφαδιαζίνη αργύρου και ορισμένα άλατα έχουν χρησιμοποιηθεί ως προϊόντα περιποίησης τραυμάτων και ως θεραπείες για μολυσματικές ασθένειες λόγω των αντιμικροβιακών τους ιδιοτήτων.6,7).Πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι τα AgNPs είναι πολύ αποτελεσματικά για την αδρανοποίηση διαφόρων τύπων βακτηρίων και ιών (8,–11).Τα ιόντα AgNP και Ag+ που απελευθερώνονται από τα AgNP αλληλεπιδρούν απευθείας με βιομόρια που περιέχουν φώσφορο ή θείο, συμπεριλαμβανομένων του DNA, του RNA και των πρωτεϊνών.12,–14).Έχει επίσης αποδειχθεί ότι παράγουν αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), προκαλώντας βλάβη στη μεμβράνη σε μικροοργανισμούς (15).Το μέγεθος, το σχήμα και η συγκέντρωση των AgNPs είναι επίσης σημαντικοί παράγοντες που επηρεάζουν τις αντιμικροβιακές τους ικανότητες.8,10,13,16,17).

Προηγούμενες μελέτες έχουν επίσης επισημάνει αρκετά προβλήματα όταν τα AgNPs χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο παθογόνων σε ένα υδάτινο περιβάλλον.Πρώτον, οι υπάρχουσες μελέτες σχετικά με την αποτελεσματικότητα των AgNPs για την απενεργοποίηση των ιικών παθογόνων στο νερό είναι περιορισμένες.Επιπλέον, τα μονοδιεσπαρμένα AgNP συνήθως υπόκεινται σε συσσωμάτωση σωματιδίων λόγω του μικρού τους μεγέθους και της μεγάλης επιφάνειάς τους, και αυτά τα συσσωματώματα μειώνουν την αποτελεσματικότητα των AgNPs έναντι μικροβιακών παθογόνων.7).Τέλος, τα AgNPs έχουν αποδειχθεί ότι έχουν διάφορες κυτταροτοξικές επιδράσεις (5,18,–20), και η απελευθέρωση AgNPs σε ένα υδάτινο περιβάλλον θα μπορούσε να οδηγήσει σε προβλήματα υγείας του ανθρώπου και οικολογικά προβλήματα.

Πρόσφατα, αναπτύξαμε ένα νέο μαγνητικό υβριδικό κολλοειδές μεγέθους μικρομέτρου (MHC) διακοσμημένο με AgNPs διαφόρων μεγεθών (21,22).Ο πυρήνας MHC μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάκτηση των σύνθετων υλικών AgNP από το περιβάλλον.Αξιολογήσαμε την αντιική αποτελεσματικότητα αυτών των νανοσωματιδίων αργύρου σε MHCs (AgNP-MHCs) χρησιμοποιώντας βακτηριοφάγο φΧ174, νοροϊό ποντικού (MNV) και αδενοϊό υπό διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες.

Αντιιικές επιδράσεις των AgNP-MHCs σε διάφορες συγκεντρώσεις έναντι του βακτηριοφάγου ϕX174 (a), MNV (b) και AdV2 (c).Οι ιοί στόχοι υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις AgNP-MHCs και με OH-MHCs (4,6 χ 109 σωματίδια/ml) ως μάρτυρα, σε επωαστήρα ανακίνησης (150 rpm, 1 ώρα, 25°C).Η μέθοδος ανάλυσης πλάκας χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση των επιζώντων ιών.Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± τυπικές αποκλίσεις (SD) από τρία ανεξάρτητα πειράματα.Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικά διαφορετικές τιμές (P< 0,05 με μονόδρομη ANOVA με δοκιμή Dunnett).

Αυτή η μελέτη έδειξε ότι τα AgNP-MHCs είναι αποτελεσματικά για την αδρανοποίηση των βακτηριοφάγων και του MNV, ενός υποκατάστατου του ανθρώπινου νοροϊού, στο νερό.Επιπλέον, τα AgNP-MHCs μπορούν εύκολα να ανακτηθούν με έναν μαγνήτη, αποτρέποντας αποτελεσματικά την απελευθέρωση δυνητικά τοξικών AgNPs στο περιβάλλον.Ένας αριθμός προηγούμενων μελετών έχει δείξει ότι η συγκέντρωση και το μέγεθος των σωματιδίων των AgNPs είναι κρίσιμοι παράγοντες για την απενεργοποίηση στοχευμένων μικροοργανισμών.8,16,17).Τα αντιμικροβιακά αποτελέσματα των AgNPs εξαρτώνται επίσης από τον τύπο του μικροοργανισμού.Η αποτελεσματικότητα των AgNP-MHCs για την απενεργοποίηση του φΧ174 ακολούθησε μια σχέση δόσης-απόκρισης.Μεταξύ των AgNP-MHC που δοκιμάστηκαν, τα Ag30-MHCs είχαν υψηλότερη αποτελεσματικότητα για την απενεργοποίηση των φΧ174 και του MNV.Για το MNV, μόνο τα Ag30-MHC εμφάνισαν αντιική δράση, με τα άλλα AgNP-MHC να μην δημιουργούν καμία σημαντική αδρανοποίηση του MNV.Κανένα από τα AgNP-MHC δεν είχε σημαντική αντιική δράση έναντι του AdV2.

Εκτός από το μέγεθος των σωματιδίων, σημαντική ήταν και η συγκέντρωση αργύρου στα AgNP-MHCs.Η συγκέντρωση του αργύρου φάνηκε να καθορίζει την αποτελεσματικότητα των αντιικών επιδράσεων των AgNP-MHCs.Οι συγκεντρώσεις αργύρου σε διαλύματα Ag07-MHCs και Ag30-MHCs σε 4,6 × 109 σωματίδια/ml ήταν 28,75 ppm και 200 ​​ppm, αντίστοιχα, και συσχετίστηκαν με το επίπεδο αντιϊκής δράσης.Πίνακας 2συνοψίζει τις συγκεντρώσεις αργύρου και τις επιφάνειες των AgNP-MHC που δοκιμάστηκαν.Τα Ag07-MHCs εμφάνισαν τη χαμηλότερη αντιική δράση και είχαν τη χαμηλότερη συγκέντρωση αργύρου και εμβαδόν επιφάνειας, υποδηλώνοντας ότι αυτές οι ιδιότητες σχετίζονται με την αντιική δράση των AgNP-MHCs.

Η προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι οι κύριοι αντιμικροβιακοί μηχανισμοί των AgNP-MHCs είναι η χημική αφαίρεση ιόντων Mg2+ ή Ca2+ από μικροβιακές μεμβράνες, η δημιουργία συμπλεγμάτων με ομάδες θειόλης που βρίσκονται στις μεμβράνες και η δημιουργία δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS)21).Επειδή τα AgNP-MHCs έχουν σχετικά μεγάλο μέγεθος σωματιδίων (~500 nm), είναι απίθανο να διεισδύσουν σε ένα ιικό καψίδιο.Αντίθετα, τα AgNP-MHCs φαίνεται να αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες ιικής επιφάνειας.Τα AgNPs στα σύνθετα υλικά τείνουν να δεσμεύουν βιομόρια που περιέχουν ομάδα θειόλης που είναι ενσωματωμένα στις πρωτεΐνες του περιβλήματος των ιών.Ως εκ τούτου, οι βιοχημικές ιδιότητες των ιικών πρωτεϊνών καψιδίου είναι σημαντικές για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας τους στα AgNP-MHCs.Φιγούρα 1δείχνει τη διαφορετική ευαισθησία των ιών στις επιδράσεις των AgNP-MHCs.Οι βακτηριοφάγοι φΧ174 και MNV ήταν ευαίσθητοι σε AgNP-MHCs, αλλά ο AdV2 ήταν ανθεκτικός.Το υψηλό επίπεδο αντίστασης του AdV2 είναι πιθανό να σχετίζεται με το μέγεθος και τη δομή του.Οι αδενοϊοί κυμαίνονται σε μέγεθος από 70 έως 100 nm (30), καθιστώντας τα πολύ μεγαλύτερα από ϕX174 (27 έως 33 nm) και MNV (28 έως 35 nm) (31,32).Εκτός από το μεγάλο τους μέγεθος, οι αδενοϊοί έχουν δίκλωνο DNA, σε αντίθεση με άλλους ιούς, και είναι ανθεκτικοί σε διάφορες περιβαλλοντικές καταπονήσεις όπως η θερμότητα και η υπεριώδης ακτινοβολία.33,34).Η προηγούμενη μελέτη μας ανέφερε ότι σχεδόν μια μείωση 3-log10 του MS2 σημειώθηκε με Ag30-MHCs εντός 6 ωρών (21).Τα MS2 και φΧ174 έχουν παρόμοια μεγέθη με διαφορετικούς τύπους νουκλεϊκών οξέων (RNA ή DNA) αλλά έχουν παρόμοια ποσοστά αδρανοποίησης από Ag30-MHCs.Επομένως, η φύση του νουκλεϊκού οξέος δεν φαίνεται να είναι ο κύριος παράγοντας για την αντοχή στα AgNP-MHCs.Αντίθετα, το μέγεθος και το σχήμα του ιικού σωματιδίου φάνηκε να είναι πιο σημαντικά, επειδή ο αδενοϊός είναι ένας πολύ μεγαλύτερος ιός.Τα Ag30-MHC πέτυχαν σχεδόν 2-log10 μείωση του M13 μέσα σε 6 ώρες (μη δημοσιευμένα δεδομένα μας).Ο M13 είναι μονόκλωνος ιός DNA (35) και έχει μήκος ~880 nm και διάμετρο 6,6 nm (36).Ο ρυθμός αδρανοποίησης του νηματοειδούς βακτηριοφάγου M13 ήταν ενδιάμεσος μεταξύ αυτών των μικρών ιών με στρογγυλή δομή (MNV, φΧ174 και MS2) και ενός μεγάλου ιού (AdV2).

Στην παρούσα μελέτη, η κινητική αδρανοποίησης του MNV ήταν σημαντικά διαφορετική στη δοκιμασία πλάκας και τη δοκιμασία RT-PCR (Εικ. 2βκαικαι γ).γ).Οι μοριακές αναλύσεις όπως η RT-PCR είναι γνωστό ότι υποτιμούν σημαντικά τους ρυθμούς αδρανοποίησης των ιών (25,28), όπως διαπιστώθηκε στη μελέτη μας.Επειδή τα AgNP-MHCs αλληλεπιδρούν κυρίως με την επιφάνεια του ιού, είναι πιο πιθανό να βλάψουν τις πρωτεΐνες του περιβλήματος του ιού παρά τα ιικά νουκλεϊκά οξέα.Επομένως, μια δοκιμασία RT-PCR για τη μέτρηση του ιικού νουκλεϊκού οξέος μπορεί να υποτιμήσει σημαντικά την απενεργοποίηση των ιών.Η επίδραση των ιόντων Ag+ και η δημιουργία δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) θα πρέπει να ευθύνονται για την αδρανοποίηση των ελεγχόμενων ιών.Ωστόσο, πολλές πτυχές των αντιιικών μηχανισμών των AgNP-MHCs είναι ακόμη ασαφείς και απαιτείται περαιτέρω έρευνα με χρήση βιοτεχνολογικών προσεγγίσεων για να διαλευκανθεί ο μηχανισμός της υψηλής αντοχής του AdV2.

Τέλος, αξιολογήσαμε την ευρωστία της αντι-ιικής δράσης των Ag30-MHCs εκθέτοντάς τους σε ένα ευρύ φάσμα τιμών pH και σε δείγματα νερού βρύσης και επιφανείας πριν μετρήσουμε την αντιική τους δράση.Εικ. 3καικαι 4).4).Η έκθεση σε συνθήκες εξαιρετικά χαμηλού pH είχε ως αποτέλεσμα τη φυσική ή/και λειτουργική απώλεια AgNPs από το MHC (μη δημοσιευμένα δεδομένα).Παρουσία μη ειδικών σωματιδίων, τα Ag30-MHCs εμφάνιζαν σταθερά αντιική δράση, παρά τη μείωση της αντιϊκής δράσης έναντι του MS2.Η αντιική δράση ήταν χαμηλότερη στα μη φιλτραρισμένα επιφανειακά ύδατα, καθώς μια αλληλεπίδραση μεταξύ Ag30-MHCs και μη ειδικών σωματιδίων στο εξαιρετικά θολό επιφανειακό νερό πιθανώς προκάλεσε μείωση της αντιϊκής δράσης (Πίνακας 3).Επομένως, στο μέλλον θα πρέπει να πραγματοποιούνται επιτόπιες αξιολογήσεις AgNP-MHC σε διάφορους τύπους νερού (π.χ. με διαφορετικές συγκεντρώσεις άλατος ή χουμικό οξύ).

Συμπερασματικά, τα νέα σύνθετα Ag, AgNP-MHCs, έχουν εξαιρετικές αντιικές ικανότητες έναντι αρκετών ιών, συμπεριλαμβανομένων των ϕX174 και MNV.Τα AgNP-MHCs διατηρούν ισχυρή αποτελεσματικότητα κάτω από διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες και αυτά τα σωματίδια μπορούν εύκολα να ανακτηθούν χρησιμοποιώντας μαγνήτη, μειώνοντας έτσι τις πιθανές επιβλαβείς επιπτώσεις τους στην ανθρώπινη υγεία και στο περιβάλλον.Αυτή η μελέτη έδειξε ότι το σύνθετο AgNP μπορεί να είναι ένα αποτελεσματικό αντιικό σε διάφορες περιβαλλοντικές ρυθμίσεις, χωρίς σημαντικούς οικολογικούς κινδύνους.