Zilveren nanodeeltjes (AgNP's) worden beschouwd als een potentieel nuttig hulpmiddel voor het bestrijden van verschillende ziekteverwekkers.Er zijn echter zorgen over de introductie van AgNP's in milieumedia, omdat deze nadelige gevolgen voor de menselijke gezondheid en het milieu kunnen hebben.In deze studie hebben we een nieuw magnetisch hybride colloïde (MHC) ter grootte van een micrometer ontwikkeld en geëvalueerd, versierd met AgNP's van verschillende grootte (AgNP-MHC's).Nadat ze zijn toegepast voor desinfectie, kunnen deze deeltjes gemakkelijk worden teruggewonnen uit omgevingsmedia met behulp van hun magnetische eigenschappen en blijven ze effectief voor het inactiveren van virale pathogenen.We evalueerden de werkzaamheid van AgNP-MHC's voor het inactiveren van bacteriofaag ϕX174, muizennorovirus (MNV) en adenovirus serotype 2 (AdV2).Deze doelvirussen werden gedurende 1, 3 en 6 uur bij 25°C blootgesteld aan AgNP-MHC's en vervolgens geanalyseerd door middel van plaque-assay en real-time TaqMan PCR.De AgNP-MHC's werden blootgesteld aan een breed scala aan pH-niveaus en aan kraan- en oppervlaktewater om hun antivirale effecten onder verschillende omgevingsomstandigheden te beoordelen.Van de drie geteste typen AgNP-MHC's vertoonden Ag30-MHC's de hoogste werkzaamheid bij het inactiveren van de virussen.De ϕX174 en MNV werden met meer dan 2 log10 verlaagd na blootstelling aan 4,6 x 109 Ag30-MHC's/ml gedurende 1 uur.Deze resultaten gaven aan dat de AgNP-MHC's zouden kunnen worden gebruikt om virale pathogenen te inactiveren met minimale kans op mogelijke introductie in het milieu.

Door de recente vooruitgang op het gebied van de nanotechnologie krijgen nanodeeltjes wereldwijd steeds meer aandacht op het gebied van de biotechnologie, de geneeskunde en de volksgezondheid (1,2).Vanwege hun hoge oppervlakte-volumeverhouding hebben materialen met nanogrootte, doorgaans variërend van 10 tot 500 nm, unieke fysisch-chemische eigenschappen vergeleken met die van grotere materialen (1).De vorm en grootte van nanomaterialen kunnen worden gecontroleerd, en specifieke functionele groepen kunnen op hun oppervlak worden geconjugeerd om interacties met bepaalde eiwitten of intracellulaire opname mogelijk te maken (3,–5).

Zilveren nanodeeltjes (AgNP’s) zijn uitgebreid bestudeerd als antimicrobieel middel.6).Zilver wordt gebruikt bij het maken van fijn bestek, voor versiering en in therapeutische middelen.Zilververbindingen zoals zilversulfadiazine en bepaalde zouten zijn gebruikt als wondverzorgingsproducten en als behandelingen voor infectieziekten vanwege hun antimicrobiële eigenschappen (6,7).Recente onderzoeken hebben aangetoond dat AgNP’s zeer effectief zijn in het inactiveren van verschillende soorten bacteriën en virussen (8,–11).AgNP's en Ag+-ionen die vrijkomen uit AgNP's hebben een directe interactie met fosfor- of zwavelhoudende biomoleculen, waaronder DNA, RNA en eiwitten (12,–14).Er is ook aangetoond dat ze reactieve zuurstofsoorten (ROS) genereren, die membraanschade veroorzaken bij micro-organismen (15).De grootte, vorm en concentratie van AgNP’s zijn ook belangrijke factoren die hun antimicrobiële eigenschappen beïnvloeden.8,10,13,16,17).

Eerdere studies hebben ook verschillende problemen aan het licht gebracht wanneer AgNP's worden gebruikt voor het bestrijden van ziekteverwekkers in een wateromgeving.Ten eerste zijn de bestaande onderzoeken naar de effectiviteit van AgNP's voor het inactiveren van virale pathogenen in water beperkt.Bovendien zijn monogedispergeerde AgNP's doorgaans onderhevig aan aggregatie van deeltjes vanwege hun kleine omvang en grote oppervlakte, en deze aggregaten verminderen de effectiviteit van AgNP's tegen microbiële pathogenen.7).Ten slotte is aangetoond dat AgNP's verschillende cytotoxische effecten hebben (5,18,–20), en de introductie van AgNP's in een wateromgeving zou kunnen leiden tot problemen voor de menselijke gezondheid en ecologische problemen.

Onlangs hebben we een nieuw magnetisch hybride colloïde (MHC) ter grootte van een micrometer ontwikkeld, versierd met AgNP's van verschillende groottes (21,22).De MHC-kern kan worden gebruikt om de AgNP-composieten uit de omgeving te halen.We evalueerden de antivirale werkzaamheid van deze zilveren nanodeeltjes op MHC's (AgNP-MHC's) met behulp van bacteriofaag ϕX174, muizennorovirus (MNV) en adenovirus onder verschillende omgevingsomstandigheden.

Antivirale effecten van AgNP-MHC's in verschillende concentraties tegen bacteriofaag ϕX174 (a), MNV (b) en AdV2 (c).Doelvirussen werden behandeld met verschillende concentraties AgNP-MHC's en met OH-MHC's (4,6 x 109 deeltjes/ml) als controle in een schudincubator (150 rpm, 1 uur, 25°C).De plaquetestmethode werd gebruikt om overlevende virussen te meten.Waarden zijn gemiddelden ± standaardafwijkingen (SD) van drie onafhankelijke experimenten.Sterretjes geven significant verschillende waarden aan (P< 0,05 volgens eenwegs-ANOVA met de test van Dunnett).

Deze studie toonde aan dat AgNP-MHC's effectief zijn voor het inactiveren van bacteriofagen en MNV, een surrogaat voor het menselijke norovirus, in water.Bovendien kunnen AgNP-MHC's gemakkelijk worden teruggewonnen met een magneet, waardoor de uitstoot van potentieel giftige AgNP's in het milieu effectief wordt voorkomen.Een aantal eerdere onderzoeken hebben aangetoond dat de concentratie en deeltjesgrootte van AgNP’s kritische factoren zijn voor het inactiveren van gerichte micro-organismen.8,16,17).De antimicrobiële effecten van AgNP's zijn ook afhankelijk van het type micro-organisme.De werkzaamheid van AgNP-MHC's voor het inactiveren van ϕX174 volgde een dosis-responsrelatie.Van de geteste AgNP-MHC's hadden Ag30-MHC's een hogere werkzaamheid voor het inactiveren van ϕX174 en MNV.Voor MNV vertoonden alleen Ag30-MHC's antivirale activiteit, terwijl de andere AgNP-MHC's geen significante inactivatie van MNV genereerden.Geen van de AgNP-MHC's had enige significante antivirale activiteit tegen AdV2.

Naast de deeltjesgrootte was ook de zilverconcentratie in de AgNP-MHC's belangrijk.De concentratie zilver leek de werkzaamheid van de antivirale effecten van AgNP-MHC's te bepalen.De zilverconcentraties in oplossingen van Ag07-MHC's en Ag30-MHC's bij 4,6 x 109 deeltjes/ml waren respectievelijk 28,75 ppm en 200 ppm, en correleerden met het niveau van antivirale activiteit.tafel 2vat de zilverconcentraties en oppervlakten van de geteste AgNP-MHC's samen.Ag07-MHC's vertoonden de laagste antivirale activiteit en hadden de laagste zilverconcentratie en oppervlakte, wat suggereert dat deze eigenschappen verband houden met de antivirale activiteit van AgNP-MHC's.

Onze eerdere studie gaf aan dat de belangrijkste antimicrobiële mechanismen van AgNP-MHC’s de chemische abstractie van Mg2+- of Ca2+-ionen uit microbiële membranen zijn, de creatie van complexen met thiolgroepen die zich op de membranen bevinden, en de generatie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) (21).Omdat AgNP-MHC's een relatief grote deeltjesgrootte hebben (~500 nm), is het onwaarschijnlijk dat ze een virale capside kunnen binnendringen.In plaats daarvan lijken AgNP-MHC's te interageren met virale oppervlakte-eiwitten.AgNP's op de composieten hebben de neiging om thiolgroepbevattende biomoleculen te binden die zijn ingebed in de manteleiwitten van virussen.Daarom zijn de biochemische eigenschappen van virale capside-eiwitten belangrijk voor het bepalen van hun gevoeligheid voor AgNP-MHC's.Figuur 1toont de verschillende gevoeligheden van de virussen voor de effecten van AgNP-MHC's.De bacteriofagen ϕX174 en MNV waren gevoelig voor AgNP-MHC's, maar AdV2 was resistent.Het hoge weerstandsniveau van AdV2 houdt waarschijnlijk verband met de omvang en structuur ervan.Adenovirussen variëren in grootte van 70 tot 100 nm (30), waardoor ze veel groter zijn dan ϕX174 (27 tot 33 nm) en MNV (28 tot 35 nm) (31,32).Naast hun grote omvang hebben adenovirussen, in tegenstelling tot andere virussen, dubbelstrengs DNA en zijn ze bestand tegen verschillende omgevingsfactoren zoals hitte en UV-straling (33,34).Onze vorige studie meldde dat er binnen 6 uur een reductie van MS2 van bijna 3 log10 plaatsvond met Ag30-MHC's (21).MS2 en ϕX174 hebben vergelijkbare afmetingen met verschillende soorten nucleïnezuur (RNA of DNA), maar hebben vergelijkbare inactiveringssnelheden door Ag30-MHC's.Daarom lijkt de aard van het nucleïnezuur niet de belangrijkste factor te zijn voor resistentie tegen AgNP-MHC's.In plaats daarvan leken de grootte en vorm van het virusdeeltje belangrijker te zijn, omdat het adenovirus een veel groter virus is.De Ag30-MHC's bereikten binnen 6 uur een reductie van M13 van bijna 2 log10 (onze niet-gepubliceerde gegevens).M13 is een enkelstrengs DNA-virus (35) en is ~880 nm lang en 6,6 nm in diameter (36).De snelheid van inactivatie van de filamenteuze bacteriofaag M13 lag tussen die van kleine, rondgestructureerde virussen (MNV, ϕX174 en MS2) en die van een groot virus (AdV2).

In de huidige studie was de inactivatiekinetiek van MNV significant verschillend in de plaquetest en de RT-PCR-test (Afb. 2bEn​enc).c).Het is bekend dat moleculaire testen zoals RT-PCR de inactiveringssnelheid van virussen aanzienlijk onderschatten (25,28), zoals bleek uit ons onderzoek.Omdat AgNP-MHC's voornamelijk interageren met het virale oppervlak, is de kans groter dat ze virale manteleiwitten beschadigen dan virale nucleïnezuren.Daarom kan een RT-PCR-test voor het meten van viraal nucleïnezuur de inactivatie van virussen aanzienlijk onderschatten.Het effect van Ag+-ionen en het genereren van reactieve zuurstofsoorten (ROS) zouden verantwoordelijk moeten zijn voor de inactivatie van de geteste virussen.Veel aspecten van de antivirale mechanismen van AgNP-MHCs zijn echter nog steeds onduidelijk, en verder onderzoek met behulp van biotechnologische benaderingen is nodig om het mechanisme van de hoge resistentie van AdV2 op te helderen.

Ten slotte hebben we de robuustheid van de antivirale activiteit van Ag30-MHC’s geëvalueerd door ze bloot te stellen aan een breed scala aan pH-waarden en aan leiding- en oppervlaktewatermonsters voordat ze hun antivirale activiteit meten (Afb. 3En​en4).4).Blootstelling aan extreem lage pH-omstandigheden resulteerde in het fysieke en/of functionele verlies van AgNP's uit de MHC (niet-gepubliceerde gegevens).In de aanwezigheid van niet-specifieke deeltjes vertoonden Ag30-MHC's consistent antivirale activiteit, ondanks een afname van de antivirale activiteit tegen MS2.De antivirale activiteit was het laagst in ongefilterd oppervlaktewater, omdat een interactie tussen Ag30-MHC’s en niet-specifieke deeltjes in het sterk troebele oppervlaktewater waarschijnlijk een vermindering van de antivirale activiteit veroorzaakte (tafel 3).Daarom moeten in de toekomst veldevaluaties van AgNP-MHC's in verschillende soorten water (bijvoorbeeld met verschillende zoutconcentraties of humuszuur) worden uitgevoerd.

Concluderend kunnen we stellen dat de nieuwe Ag-composieten, AgNP-MHCs, uitstekende antivirale eigenschappen hebben tegen verschillende virussen, waaronder ϕX174 en MNV.AgNP-MHC's behouden een sterke werkzaamheid onder verschillende omgevingsomstandigheden, en deze deeltjes kunnen gemakkelijk worden teruggewonnen met behulp van een magneet, waardoor hun potentiële schadelijke effecten op de menselijke gezondheid en het milieu worden verminderd.Deze studie toonde aan dat het AgNP-composiet een effectief antiviraal middel kan zijn in verschillende omgevingsomgevingen, zonder significante ecologische risico's.