Наночастицы серебра (AgNP) считаются потенциально полезным инструментом для борьбы с различными патогенами.Однако существуют опасения по поводу попадания AgNP в окружающую среду, поскольку они могут вызвать неблагоприятные последствия для здоровья человека и экологии.В этом исследовании мы разработали и оценили новый магнитный гибридный коллоид (MHC) микронного размера, украшенный AgNP различного размера (AgNP-MHC).После применения для дезинфекции эти частицы можно легко извлечь из окружающей среды, используя их магнитные свойства, и они остаются эффективными для инактивации вирусных патогенов.Мы оценили эффективность AgNP-MHC для инактивации бактериофага φX174, мышиного норовируса (MNV) и аденовируса серотипа 2 (AdV2).Эти целевые вирусы подвергались воздействию AgNP-MHC в течение 1, 3 и 6 часов при 25°C, а затем анализировались с помощью анализа бляшек и TaqMan PCR в реальном времени.AgNP-MHC подвергались воздействию широкого диапазона уровней pH, а также водопроводной и поверхностной воды для оценки их противовирусного действия в различных условиях окружающей среды.Среди трех протестированных типов AgNP-MHC Ag30-MHC продемонстрировали наибольшую эффективность в инактивации вирусов.φX174 и MNV снижались более чем на 2 log10 после воздействия 4,6 × 109 Ag30-MHC/мл в течение 1 часа.Эти результаты показали, что AgNP-MHC можно использовать для инактивации вирусных патогенов с минимальной вероятностью потенциального выброса в окружающую среду.

Благодаря недавним достижениям в области нанотехнологий наночастицам во всем мире уделяется повышенное внимание в области биотехнологий, медицины и общественного здравоохранения.1,2).Благодаря высокому соотношению поверхности к объему наноматериалы, обычно размером от 10 до 500 нм, обладают уникальными физико-химическими свойствами по сравнению со свойствами более крупных материалов.1).Форму и размер наноматериалов можно контролировать, а на их поверхности можно конъюгировать определенные функциональные группы, чтобы обеспечить взаимодействие с определенными белками или внутриклеточное поглощение.3,–5).

Наночастицы серебра (AgNP) широко изучаются как антимикробное средство.6).Серебро используется для изготовления изысканных столовых приборов, украшений и лечебных средств.Соединения серебра, такие как сульфадиазин серебра и некоторые соли, использовались в качестве средств для ухода за ранами и для лечения инфекционных заболеваний из-за их противомикробных свойств.6,7).Недавние исследования показали, что AgNP очень эффективны для инактивации различных типов бактерий и вирусов.8,–11).AgNP и ионы Ag+, высвобождаемые из AgNP, напрямую взаимодействуют с фосфор- или серосодержащими биомолекулами, включая ДНК, РНК и белки (12,–14).Также было показано, что они генерируют активные формы кислорода (АФК), вызывая повреждение мембран микроорганизмов.15).Размер, форма и концентрация AgNP также являются важными факторами, влияющими на их антимикробные возможности.8,10,13,16,17).

Предыдущие исследования также выявили несколько проблем, связанных с использованием AgNP для борьбы с патогенами в водной среде.Во-первых, существующие исследования эффективности AgNP для инактивации вирусных патогенов в воде ограничены.Кроме того, монодисперсные AgНЧ обычно подвержены агрегации между частицами из-за их небольшого размера и большой площади поверхности, и эти агрегаты снижают эффективность AgNP против микробных патогенов.7).Наконец, было показано, что AgNP обладают различными цитотоксическими эффектами (5,18,–20), а выброс AgNP в водную среду может привести к проблемам со здоровьем человека и экологии.

Недавно мы разработали новый магнитный гибридный коллоид (MHC) микронного размера, украшенный AgNP различных размеров (21,22).Ядро MHC можно использовать для извлечения композитов AgNP из окружающей среды.Мы оценили противовирусную эффективность этих наночастиц серебра в отношении MHC (AgNP-MHC) с использованием бактериофага φX174, мышиного норовируса (MNV) и аденовируса в различных условиях окружающей среды.

Противовирусное действие AgNP-MHC в различных концентрациях против бактериофага φX174 (а), MNV (б) и AdV2 (в).Целевые вирусы обрабатывали различными концентрациями AgNP-MHC и OH-MHC (4,6 × 109 частиц/мл) в качестве контроля в качающемся инкубаторе (150 об/мин, 1 час, 25°C).Метод анализа бляшек использовался для измерения выживших вирусов.Значения представляют собой средние значения ± стандартные отклонения (SD) из трех независимых экспериментов.Звездочки обозначают существенно разные значения (P<0,05 по однофакторному дисперсионному анализу с критерием Даннетта).

Это исследование продемонстрировало, что AgNP-MHC эффективны для инактивации бактериофагов и MNV, суррогата норовируса человека, в воде.Кроме того, AgNP-MHC можно легко восстановить с помощью магнита, что эффективно предотвращает выброс потенциально токсичных AgNP в окружающую среду.Ряд предыдущих исследований показали, что концентрация и размер частиц AgNP являются критическими факторами для инактивации целевых микроорганизмов.8,16,17).Антимикробное действие AgNP также зависит от типа микроорганизма.Эффективность AgNP-MHC для инактивации φX174 зависела от зависимости «доза-реакция».Среди протестированных AgNP-MHC Ag30-MHC обладали более высокой эффективностью в инактивации φX174 и MNV.Что касается MNV, только Ag30-MHC проявляли противовирусную активность, тогда как другие AgNP-MHC не вызывали какой-либо значительной инактивации MNV.Ни один из AgNP-MHC не обладал значительной противовирусной активностью против AdV2.

Помимо размера частиц, важна также концентрация серебра в AgNP-MHC.Концентрация серебра, по-видимому, определяет эффективность противовирусного действия AgNP-MHC.Концентрация серебра в растворах Ag07-MHC и Ag30-MHC при 4,6 × 109 частиц/мл составляла 28,75 и 200 ppm соответственно и коррелировала с уровнем противовирусной активности.Таблица 2суммирует концентрации серебра и площади поверхности протестированных AgNP-MHC.Ag07-MHC проявляли самую низкую противовирусную активность и имели самую низкую концентрацию серебра и площадь поверхности, что позволяет предположить, что эти свойства связаны с противовирусной активностью AgNP-MHC.

Наше предыдущее исследование показало, что основными антимикробными механизмами AgNP-MHC являются химическое абстрагирование ионов Mg2+ или Ca2+ от микробных мембран, создание комплексов с тиоловыми группами, расположенными на мембранах, и генерация активных форм кислорода (АФК) (21).Поскольку AgNP-MHC имеют относительно большой размер частиц (~500 нм), маловероятно, что они смогут проникнуть через вирусный капсид.Вместо этого AgNP-MHC, по-видимому, взаимодействуют с поверхностными белками вируса.AgNP на композитах имеют тенденцию связывать биомолекулы, содержащие тиоловые группы, встроенные в белки оболочки вирусов.Следовательно, биохимические свойства белков вирусного капсида важны для определения их чувствительности к AgNP-MHC.Рисунок 1показывает различную восприимчивость вирусов к воздействию AgNP-MHC.Бактериофаги φX174 и MNV были чувствительны к AgNP-MHC, но AdV2 был устойчив.Высокий уровень устойчивости AdV2, вероятно, связан с его размером и структурой.Размер аденовирусов варьируется от 70 до 100 нм (30), что делает их намного больше, чем φX174 (от 27 до 33 нм) и MNV (от 28 до 35 нм) (31,32).Помимо большого размера, аденовирусы имеют двухцепочечную ДНК, в отличие от других вирусов, и устойчивы к различным воздействиям окружающей среды, таким как тепло и УФ-излучение.33,34).В нашем предыдущем исследовании сообщалось, что снижение MS2 почти на 3 log10 произошло при использовании Ag30-MHC в течение 6 часов (21).MS2 и φX174 имеют одинаковые размеры с разными типами нуклеиновых кислот (РНК или ДНК), но имеют одинаковую скорость инактивации Ag30-MHC.Следовательно, природа нуклеиновой кислоты, по-видимому, не является основным фактором устойчивости к AgNP-MHC.Вместо этого размер и форма вирусной частицы оказались более важными, поскольку аденовирус — гораздо более крупный вирус.Ag30-MHC достигли почти 2-log10-снижения M13 в течение 6 часов (наши неопубликованные данные).М13 — вирус с одноцепочечной ДНК (35) и имеет длину ~880 нм и диаметр 6,6 нм (36).Скорость инактивации нитчатого бактериофага М13 была промежуточной между таковыми у небольших вирусов с округлой структурой (MNV, φX174 и MS2) и крупных вирусов (AdV2).

В настоящем исследовании кинетика инактивации MNV значительно различалась при анализе бляшек и анализе RT-PCR (Рис. 2би​иc).c).Известно, что молекулярные анализы, такие как RT-PCR, значительно недооценивают скорость инактивации вирусов.25,28), как было установлено в нашем исследовании.Поскольку AgNP-MHC взаимодействуют в первую очередь с поверхностью вируса, они с большей вероятностью повреждают белки вирусной оболочки, а не вирусные нуклеиновые кислоты.Следовательно, анализ RT-PCR для измерения нуклеиновой кислоты вируса может значительно недооценивать инактивацию вирусов.Эффект ионов Ag+ и образование активных форм кислорода (АФК) должны быть ответственны за инактивацию тестируемых вирусов.Однако многие аспекты противовирусных механизмов AgNP-MHC до сих пор неясны, и необходимы дальнейшие исследования с использованием биотехнологических подходов для выяснения механизма высокой устойчивости AdV2.

Наконец, мы оценили надежность противовирусной активности Ag30-MHC, подвергая их воздействию широкого диапазона значений pH, а также образцам водопроводной и поверхностной воды перед измерением их противовирусной активности (Рис. 3и​и4).4).Воздействие условий чрезвычайно низкого pH привело к физической и/или функциональной потере AgNP из MHC (неопубликованные данные).В присутствии неспецифических частиц Ag30-MHC стабильно проявляли противовирусную активность, несмотря на снижение противовирусной активности против MS2.Противовирусная активность была самой низкой в ​​нефильтрованной поверхностной воде, поскольку взаимодействие между Ag30-MHC и неспецифическими частицами в сильно мутной поверхностной воде, вероятно, вызывало снижение противовирусной активности (Таблица 3).Поэтому в будущем следует провести полевые оценки AgNP-MHC в различных типах воды (например, с различными концентрациями солей или гуминовых кислот).

В заключение отметим, что новые композиты Ag, AgNP-MHC, обладают отличными противовирусными свойствами против нескольких вирусов, включая φX174 и MNV.AgNP-MHC сохраняют высокую эффективность в различных условиях окружающей среды, и эти частицы можно легко восстановить с помощью магнита, что снижает их потенциальное вредное воздействие на здоровье человека и окружающую среду.Это исследование показало, что композит AgNP может быть эффективным противовирусным средством в различных условиях окружающей среды без значительных экологических рисков.