ננו-חלקיקי כסף (AgNPs) נחשבים לכלי שימושי פוטנציאלי לשליטה בפתוגנים שונים.עם זאת, יש חששות לגבי שחרור של AgNPs לתקשורת סביבתית, מכיוון שהם עלולים ליצור השפעות שליליות על בריאות האדם והשפעות אקולוגיות.במחקר זה, פיתחנו והערכנו קולואיד היברידי מגנטי חדש בגודל מיקרומטר (MHC) המעוטר ב-AgNPs בגדלים שונים (AgNP-MHCs).לאחר הגשתם לחיטוי, ניתן לשחזר בקלות חלקיקים אלה ממדיה סביבתית באמצעות התכונות המגנטיות שלהם ולהישאר יעילים להשבתת פתוגנים ויראליים.הערכנו את היעילות של AgNP-MHCs להשבתת בקטריופאג ϕX174, נורו-וירוס עכברי (MNV) וסרוטיפ אדנו-וירוס 2 (AdV2).נגיפי יעד אלו נחשפו ל-AgNP-MHCs למשך 1, 3 ו-6 שעות ב-25 מעלות צלזיוס ולאחר מכן נותחו על ידי בדיקת פלאק ו-TaqMan PCR בזמן אמת.ה-AgNP-MHCs נחשפו למגוון רחב של רמות pH ולמי ברז ולמי עילי כדי להעריך את ההשפעות האנטי-ויראליות שלהם בתנאי סביבה שונים.מבין שלושת סוגי AgNP-MHCs שנבדקו, Ag30-MHCs הציגו את היעילות הגבוהה ביותר להשבתת הנגיפים.ה-ϕX174 ו-MNV הופחתו ביותר מ-2 log10 לאחר חשיפה ל-4.6 × 109 Ag30-MHCs/ml למשך שעה.תוצאות אלו הצביעו על כך שניתן להשתמש ב- AgNP-MHCs כדי להשבית פתוגנים ויראליים עם סיכוי מינימלי לשחרור פוטנציאלי לסביבה.

עם ההתקדמות האחרונה בננוטכנולוגיה, ננו-חלקיקים זוכים לתשומת לב מוגברת ברחבי העולם בתחומי הביוטכנולוגיה, הרפואה ובריאות הציבור (1,2).הודות ליחס המשטח לנפח הגבוה שלהם, לחומרים בגודל ננו, הנעים בדרך כלל בין 10 ל-500 ננומטר, יש תכונות פיזיקוכימיות ייחודיות בהשוואה לאלו של חומרים גדולים יותר (1).ניתן לשלוט על הצורה והגודל של ננו-חומרים, וניתן להצמיד קבוצות פונקציונליות ספציפיות על פני השטח שלהם כדי לאפשר אינטראקציות עם חלבונים מסוימים או קליטה תוך-תאית (3,–5).

ננו-חלקיקי כסף (AgNPs) נחקרו בהרחבה כחומר אנטי-מיקרוביאלי (6).כסף משמש ליצירת סכו"ם משובחים, לקישוטים ובסוכנים טיפוליים.תרכובות כסף כמו כסף סולפדיאזין ומלחים מסוימים שימשו כמוצרים לטיפול בפצעים וכטיפולים למחלות זיהומיות בשל תכונותיהם האנטי-מיקרוביאליות (6,7).מחקרים אחרונים גילו כי AgNPs יעילים מאוד להשבתת סוגים שונים של חיידקים ווירוסים (8,–11).AgNPs ו- Ag+ יוני המשתחררים מ- AgNPs אינטראקציה ישירה עם ביו-מולקולות המכילות זרחן או גופרית, כולל DNA, RNA וחלבונים (12,–14).כמו כן, הוכח כי הם יוצרים מיני חמצן תגובתיים (ROS), וגורמים נזק לממברנה במיקרואורגניזמים (15).הגודל, הצורה והריכוז של AgNPs הם גם גורמים חשובים המשפיעים על היכולות האנטי-מיקרוביאליות שלהם (8,10,13,16,17).

מחקרים קודמים גם הדגישו מספר בעיות כאשר משתמשים ב-AgNP לשליטה בפתוגנים בסביבת מים.ראשית, מחקרים קיימים על היעילות של AgNPs להשבתת פתוגנים ויראליים במים מוגבלים.בנוסף, AgNPs מונופזורים נתונים בדרך כלל לצבירה של חלקיקים-חלקיקים בגלל גודלם הקטן ושטח הפנים הגדול שלהם, ואגרגטים אלה מפחיתים את היעילות של AgNPs נגד פתוגנים מיקרוביאליים (7).לבסוף, הוכחו ל- AgNP השפעות ציטוטוקסיות שונות (5,18,–20), ושחרור AgNPs לסביבת מים עלול לגרום לבריאות האדם ולבעיות אקולוגיות.

לאחרונה, פיתחנו קולואיד היברידי מגנטי (MHC) חדש בגודל מיקרומטר המעוטר ב-AgNP בגדלים שונים (21,22).ניתן להשתמש בליבת MHC כדי לשחזר את חומרי ה-AgNP מהסביבה.הערכנו את היעילות האנטי-ויראלית של ננו-חלקיקי כסף אלה על MHCs (AgNP-MHCs) באמצעות בקטריופאג ϕX174, נורו-וירוס עכברי (MNV) ואדנו-וירוס בתנאים סביבתיים שונים.

השפעות אנטי-ויראליות של AgNP-MHCs בריכוזים שונים נגד בקטריופאג ϕX174 (א), MNV (b) ו-AdV2 (c).וירוסי המטרה טופלו בריכוזים שונים של AgNP-MHCs, ועם OH-MHCs (4.6 × 109 חלקיקים/מ"ל) כביקורת, באינקובטור מטלטל (150 סל"ד, שעה אחת, 25 מעלות צלזיוס).שיטת בדיקת הפלאק שימשה למדידת וירוסים ששרדו.ערכים הם אמצעים ± סטיות תקן (SD) משלושה ניסויים בלתי תלויים.כוכביות מצביעות על ערכים שונים באופן משמעותי (P< 0.05 לפי ANOVA חד כיווני עם הבדיקה של דאנט).

מחקר זה הראה כי AgNP-MHCs יעילים להשבתת בקטריופאג'ים ו-MNV, פונדקאית לנורו-וירוס אנושי, במים.בנוסף, ניתן לשחזר בקלות AgNP-MHCs עם מגנט, ולמעשה מונע שחרור של AgNPs שעלול להיות רעילים לסביבה.מספר מחקרים קודמים הראו שהריכוז וגודל החלקיקים של AgNPs הם גורמים קריטיים להשבתת מיקרואורגניזם ממוקד (8,16,17).ההשפעות האנטי-מיקרוביאליות של AgNPs תלויות גם בסוג המיקרואורגניזם.היעילות של AgNP-MHCs להשבתת ϕX174 עקבה אחר קשר מינון-תגובה.בין AgNP-MHCs שנבדקו, Ag30-MHCs הייתה בעלת יעילות גבוהה יותר להשבתת ϕX174 ו-MNV.עבור MNV, רק Ag30-MHCs הציגו פעילות אנטי-ויראלית, כאשר שאר AgNP-MHCs לא יצרו אי-אקטיבציה משמעותית של MNV.לאף אחד מה-AgNP-MHCs לא הייתה פעילות אנטי-ויראלית משמעותית נגד AdV2.

בנוסף לגודל החלקיקים, ריכוז הכסף ב-AgNP-MHCs היה גם חשוב.נראה שריכוז הכסף קובע את היעילות של ההשפעות האנטי-ויראליות של AgNP-MHCs.ריכוזי הכסף בתמיסות של Ag07-MHCs ו-Ag30-MHCs ב-4.6 × 109 חלקיקים/מ"ל היו 28.75 ppm ו-200 ppm, בהתאמה, ומתואמים עם רמת הפעילות האנטי-ויראלית.שולחן 2מסכם את ריכוזי הכסף ושטחי הפנים של AgNP-MHCs שנבדקו.Ag07-MHCs הציגו את הפעילות האנטי-ויראלית הנמוכה ביותר והיו בעלי ריכוז הכסף ושטח הפנים הנמוכים ביותר, מה שמצביע על כך שתכונות אלו קשורות לפעילות האנטי-ויראלית של AgNP-MHCs.

המחקר הקודם שלנו הצביע על כך שהמנגנונים האנטי-מיקרוביאליים העיקריים של AgNP-MHCs הם ההפשטה הכימית של יוני Mg2+ או Ca2+ ממברנות מיקרוביאליות, יצירת קומפלקסים עם קבוצות תיול הממוקמות בממברנות, ויצירת מיני חמצן תגובתיים (ROS) (21).מכיוון של AgNP-MHCs יש גודל חלקיקים גדול יחסית (כ-500 ננומטר), לא סביר שהם יכולים לחדור לקפסיד ויראלי.במקום זאת, נראה כי AgNP-MHCs מקיימים אינטראקציה עם חלבוני משטח ויראליים.AgNPs על החומרים המרוכבים נוטים לקשור ביומולקולות המכילות קבוצת תיול המוטבעות בחלבוני המעיל של וירוסים.לכן, התכונות הביוכימיות של חלבוני קפסיד ויראליים חשובות לקביעת רגישותם ל-AgNP-MHCs.איור 1מראה את הרגישויות השונות של הנגיפים להשפעות של AgNP-MHCs.הבקטריופאג'ים ϕX174 ו-MNV היו רגישים ל-AgNP-MHCs, אך AdV2 היה עמיד.רמת ההתנגדות הגבוהה של AdV2 עשויה להיות קשורה לגודל ולמבנה שלו.גודלם של אדנוווירוסים נע בין 70 ל-100 ננומטר (30), מה שהופך אותם לגדולים בהרבה מ-ϕX174 (27 עד 33 ננומטר) ו-MNV (28 עד 35 ננומטר) (31,32).בנוסף לגודלם הגדול, לאדנו-וירוס יש DNA דו-גדילי, שלא כמו וירוסים אחרים, והם עמידים ללחצים סביבתיים שונים כמו חום וקרינת UV (33,34).המחקר הקודם שלנו דיווח שכמעט הפחתה של 3-log10 של MS2 התרחשה עם Ag30-MHCs בתוך 6 שעות (21).ל-MS2 ול-ϕX174 יש גדלים דומים עם סוגים שונים של חומצת גרעין (RNA או DNA) אך יש להם שיעורי ביטול דומים על ידי Ag30-MHCs.לכן, טבעה של חומצת הגרעין אינו נראה כגורם העיקרי לעמידות בפני AgNP-MHCs.במקום זאת, נראה היה שהגודל והצורה של חלקיק הנגיפי היו חשובים יותר, מכיוון שאדנוווירוס הוא וירוס הרבה יותר גדול.ה-Ag30-MHCs השיגו כמעט הפחתה של 2-log10 של M13 תוך 6 שעות (הנתונים שלא פורסמו שלנו).M13 הוא וירוס DNA חד גדילי (35) ואורכו ~880 ננומטר וקוטר 6.6 ננומטר (36).קצב אי ההפעלה של הבקטריופאג החוטי M13 היה ביניים בין אלה של וירוסים קטנים בעלי מבנה עגול (MNV, ϕX174 ו-MS2) לבין וירוס גדול (AdV2).

במחקר הנוכחי, קינטיקה של אינאקטיבציה של MNV הייתה שונה באופן משמעותי במבחן הפלאק ובמבחן RT-PCR (איור 2בוandc).ג).מבחנים מולקולריים כגון RT-PCR ידועים כממעיטים באופן משמעותי בשיעורי אי ההפעלה של וירוסים (25,28), כפי שנמצא במחקר שלנו.מכיוון ש-AgNP-MHCs מקיימים אינטראקציה בעיקר עם פני השטח הוויראליים, יש סיכוי גבוה יותר שהם יפגעו בחלבוני המעטפת הוויראליים במקום לחומצות גרעין ויראליות.לכן, בדיקת RT-PCR למדידת חומצת גרעין ויראלית עשויה להמעיט באופן משמעותי בהשבתת הנגיפים.ההשפעה של יוני Ag+ ויצירת מיני חמצן תגובתיים (ROS) צריכה להיות אחראית להשבתת הנגיפים שנבדקו.עם זאת, היבטים רבים של המנגנונים האנטי-ויראליים של AgNP-MHCs עדיין לא ברורים, ונדרש מחקר נוסף באמצעות גישות ביוטכנולוגיות כדי להבהיר את מנגנון העמידות הגבוהה של AdV2.

לבסוף, הערכנו את החוסן של הפעילות האנטי-ויראלית של Ag30-MHCs על ידי חשיפתם למגוון רחב של ערכי pH ולדגימות מי ברז ומשטח לפני מדידת הפעילות האנטי-ויראלית שלהם (איור 3וו4).4).חשיפה לתנאי pH נמוך במיוחד גרמה לאובדן פיזי ו/או תפקודי של AgNPs מה-MHC (נתונים שלא פורסמו).בנוכחות חלקיקים לא ספציפיים, Ag30-MHCs הציגו באופן עקבי פעילות אנטי-ויראלית, למרות ירידה בפעילות האנטי-ויראלית נגד MS2.הפעילות האנטי-ויראלית הייתה הנמוכה ביותר במים עיליים לא מסוננים, שכן אינטראקציה בין Ag30-MHCs וחלקיקים לא ספציפיים במים העכורים מאוד גרמה כנראה להפחתה בפעילות האנטי-ויראלית (שולחן 3).לכן, יש לבצע הערכות שדה של AgNP-MHCs בסוגים שונים של מים (למשל, עם ריכוזי מלח שונים או חומצה הומית) בעתיד.

לסיכום, לחומרי ה-Ag החדשים, AgNP-MHCs, יש יכולות אנטי-ויראליות מצוינות נגד מספר וירוסים, כולל ϕX174 ו-MNV.AgNP-MHCs שומרים על יעילות חזקה בתנאי סביבה שונים, וניתן לשחזר חלקיקים אלה בקלות באמצעות מגנט, ובכך להפחית את ההשפעות המזיקות הפוטנציאליות שלהם על בריאות האדם והסביבה.מחקר זה הראה שחומר ה-AgNP יכול להיות אנטי-ויראלי יעיל במסגרות סביבתיות שונות, ללא סיכונים אקולוגיים משמעותיים.